《Beverages》：Combination of Destructive and Non-Destructive Analyses for Microbiological and Qualitative Characterization of Refermented and Yeast-Aged Apple Cider
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在意大利，苹果西打酒（Apple Cider）市场正显著增长，众多小型手工生产者将当地苹果品种与传统工艺结合，生产复杂多样的产品。然而，基于自发发酵（spontaneous fermentation）的手工生产常面临品质重现性难题，尤指感官稳定性（不同年份间）
在意大利，苹果西打酒（Apple Cider）市场正显著增长，众多小型手工生产者将当地苹果品种与传统工艺结合，生产复杂多样的产品。然而，基于自发发酵（spontaneous fermentation）的手工生产常面临品质重现性难题，尤指感官稳定性（不同年份间）和产品高浊度问题。本研究旨在优化意大利马尔凯大区Contrada Contro酒庄的西打酒生产工艺。研究人员从2023年份冷冻苹果汁（must）中分离筛选本土酵母（indigenous yeasts），经初步鉴定后用于静止西打酒的瓶内二次发酵（refermentation in bottle），随后进行7个月瓶储陈酿，并于酒泥（lees）陈酿14个月后第二次取样。采用破坏性分析——高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）和气相色谱-质谱（GC-MS）分别测定多酚及挥发性化合物；同时采用非破坏性分析——12-石英微天平电子鼻（E-nose based on quartz microbalance, QMB）及近红外（Near Infrared, NIR）光谱对生产工艺进行快速评估。色谱分析结果表明，二次发酵产品的感官品质受接种酵母菌株组成显著影响。所有接种筛选酵母的处理组浊度均低于自发发酵对照组。研究结果表明，选用本土酵母进行西打瓶内二次发酵可生产高品质产品，富含有益化合物且具有鲜明风土（terroir）特征，强调了微生物风土（microbial terroir）的重要性。
一、研究背景与目的
意大利苹果西打酒（Apple Cider）市场近年因手工酿造及地方品种开发而快速增长，但基于自发发酵（spontaneous fermentation）的工艺导致产品批次间感官品质重现性差、浊度高，限制了其商业化与品质提升。瓶内二次发酵（refermentation in bottle）结合酒泥陈酿（aging on lees / sur lie）可赋予产品气泡、复杂香气（源于酵母自溶 autolysis 释放甘露糖蛋白等）及氧化稳定性，但其效果受控于酵母种类。为兼顾工艺标准化与微生物风土（microbial terroir）保留，研究人员从2023年西比里尼山脉粉红苹果冷冻汁（frozen must）中分离本土酵母（indigenous yeasts），构建不同酵母组合进行瓶内二次发酵，分别于7个月和14个月酒泥陈酿后采样，联合破坏性（HPLC-DAD测多酚、HS-GC/MS测挥发性有机物 VOCs）与非破坏性（12-QMB电子鼻 E-nose、NIR-AOTF近红外光谱）手段表征，探讨本土酵母复配剂对西打酒化学组分及芳香指纹的影响。该论文发表于《Beverages》。
二、主要关键技术方法
研究人员采集意大利马尔凯大区Contrada Contro酒庄2023年西比里尼山脉粉红苹果冷冻汁（生物材料），解冻后于18℃与28℃活化，涂布YPD琼脂与WL显色培养基及赖氨酸培养基分离鉴定酿酒酵母（Saccharomyces spp.）与非酿酒酵母（non-Saccharomyces，如Hanseniaspora），筛选22～23℃生长良好菌株配成3种混合菌剂（Mix A含3株Saccharomyces、Mix B含2株Saccharomyces＋1株Hanseniaspora、Mix C含全部6株）及商业S. cerevisiae对照（CK），接种至500 mL静止西打酒进行15℃瓶内二次发酵与酒泥陈酿。取样时间点：7个月（T1）与14个月（T2）。破坏性分析：HPLC-DAD（C18柱，磷酸盐缓冲液-乙腈梯度洗脱）定量单体多酚（原花青素、表儿茶素、酚酸、白藜芦醇等），顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS/NIST库≥80%匹配）分析VOCs相对百分含量。非破坏性分析：12-石英微天平电子鼻（QMBs功能化金属卟啉/ Corrole）采集顶空响应指纹，NIR-AOTF（1100～2300 nm透射，Savitzky–Golay导数预处理）获取光谱。数据经自动标度化后做主成分分析（PCA）、分层聚类（HCA/Ward法）及双因素ANOVA（p≤0.05 Tukey HSD）。
三、研究结果
3.1. Isolation of Autochthonous Yeast Strains（本土酵母的分离）
解冻汁液18℃与28℃孵育48 h后涂布平板，两温度总酵母计数无显著差异（约0.9～1.12×101? CFU/mL），但18℃亚适温复活样品分离出更多样菌落形态（10种形态中9种源自18℃），表明亚适温利于保存原始基质生物多样性。6株（A、E、G、I、Lr为Saccharomyces spp.，L为Hanseniaspora sp.可于赖氨酸培养基生长且具柠檬形细胞）在22～23℃ YPD中OD???＞10，被选作后续启动培养。
3.2. Phenotypic Characterization of the Selected Yeast Strains（选定酵母菌株的表型特征）
显微形态与赖氨酸培养基生长试验确认5株为Saccharomyces spp.（不利用赖氨酸），1株L为Hanseniaspora sp.（可生长、WL培养基呈绿色、尖形细胞），后者常见于发酵初期并贡献果香。据此配制3个接种混合液：Mix A（A＋E＋G，均为Saccharomyces），Mix B（I＋Lr＋L，含非酿酒酵母），Mix C（全部6株模拟自发发酵多样性），以商业S. cerevisiae为CK。
3.3. Polyphenol Analysis（多酚分析）
HPLC-DAD结果显示，与原静止西打酒相比，所有处理总原花青素（total procyanidins）在T1下降（CK≈10%，A≈13%，B≈27%，C≈37%），T2进一步下降；表儿茶素（epicatechin）温和降低。总酚酸（total phenolic acids）随酒泥陈酿升高，T2时A/B/C组达约10 mg/L（高于CK缓升），其中咖啡酸（caffeic acid）与4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid）在土著酵母组增幅更显著（后者超120%），归因于酵母自溶（yeast autolysis）释放胞内酶。白藜芦醇（resveratrol）T2时CK增16%、A增55%、B增51%、C增35%（高于通常吸附降解趋势），可能与二次发酵中酵母相互作用促使其溶出有关。PCA（前两PC累计89.16%）显示CK T2关联没食子酸与4-羟基苯甲酸，A/B/C T2关联B类原花青素与白藜芦醇，说明土著酵母酒泥陈酿改变多酚分布模式。
3.4. VOC Analysis（挥发性有机物分析）
HS-GC-MS检出29种VOCs（醇、醛、酮、酯、有机酸、萜类）。PCA显示静止西打酒单独聚类；T1时各处理关联高级醇（3-甲基-1-丁醇等，Ehrlich途径），T2时CK靠近乙酸甲酯，而A/B/C T2明显分离于第一象限，强关联辛酸甲酯（methyl octanoate）、丁酸乙酯（ethyl butyrate）、2-甲基丁酸乙酯（ethyl 2-methylbutyrate）、丁二酸二乙酯（diethyl succinate）及芳樟醇（linalool，源于Hanseniaspora共接种上调MVA途径）、2-十六烷醇（源自酵母自溶脂肪酸前体），表明土著酵母（尤其含非酿酒酵母）促进果香/花香酯与单萜生成，赋予独特芳香谱。
3.5. E-Nose Computation（电子鼻数据分析）
12-QMB电子鼻响应经PCA（PC1 66.51%＋PC2 31.93%＝95.44%）显示静止西打酒孤立于第三象限；T1各二次发酵组聚于第二三象限间；T2时CK与A重叠于第四象限（响应QMB1/3/5/6/7，对极性乙醇/乙酸敏感），B与C聚于第一象限（响应QMB2/4/8–10/12，Zn功能化传感器对乙醛等醛类敏感），证实不同酵母组合产生可区分整体芳香指纹，含Hanseniaspora的混合菌剂（B、C）芳香模式相似且与A、CK不同。
3.6. NIR Computation（近红外光谱分析）
NIR透射光谱（1100～2300 nm）经二阶导数及均值中心化后做HCA，树状图形成两大簇：静止西打酒单独一簇，所有二次发酵产品归为另一大簇并再按T1/T2细分（仅CK T1因光谱特征近似T2某样品略有交叉），证明NIR可无损区分基酒与二次发酵产物及陈酿阶段。
四、讨论与结论总结（翻译结论部分）
西打酒受瓶内二次发酵接种策略显著影响。本研究中，源自原果汁的微生物对接种西打酒的多酚、VOCs及电子鼻整体芳香指纹具不同作用。关于单体多酚，接种混合菌剂A、B、C（分别为3株Saccharomyces、2株Saccharomyces＋1株non-Saccharomyces、全部6株）的西打酒在T2白藜芦醇显著升高，原花青素与表儿茶素降低，改善单宁涩感柔和度。酚酸方面，咖啡酸明显升高，可能源于T2酵母自溶期间酶释放。VOCs方面，本研究用混合菌剂二次发酵的西打酒特征性合成多种酯（辛酸甲酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯）及具强芳香影响的萜烯——芳樟醇（linalool）；2-十六烷醇亦关联三株二次发酵西打酒，似源自酵母自溶释放脂肪酸前体。电子鼻监测显示瓶内二次发酵令样品清晰分离：对照（CK）与混合菌剂A二次发酵西打酒整体相似性较高，而混合菌剂B与C基于芳香谱聚为一类。不同西打酒样品NIR光谱多元分析可明确区分静止西打酒与二次发酵产品（归为单簇），但采样时间点未见明显分隔。综上，选用源自原果汁、保留微生物风土痕迹的微生物进行接种是可行且具推广价值的策略。未来研究应深入鉴定每株本土酵母并探索不同共接种策略以筛选最具协同效应的组合，进一步优化终产品感官属性。
