小麦秸秆来源木寡糖（Xylooligosaccharides，XOSWS）的益生元、抗氧化及免疫调节特性

《Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre》：Prebiotic, Antioxidant, and Immunomodulatory Properties of Wheat Straw-Derived Xylooligosaccharides

　　

摘要：木寡糖（xylooligosaccharides，XOS）是一类新兴的益生元，其生物学功能受结构特征（取决于来源和生产方法）的强烈影响。本研究旨在评估由小麦秸秆（wheat straw，WS）衍生的XOS水解物粉末（XOSWS，一种丰富的木质纤维素副产物）的结构特征、消化性、益生元及生物活性特性。XOS通过碱预处理结合酶水解生产，并采用高效液相色谱-示差折光检测器（HPLC-RID）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行表征，确认存在聚合度（degree of polymerization，DP）介于2和6之间的寡聚物，这些寡聚物与高益生元潜力相关。研究人员利用大鼠小肠提取物（rat small intestine extract，RSIE）进行的体外消化实验表明，大多数XOS可抵抗肠道酶解水解，支持其基本完整地到达结肠的能力。采用单一菌株进行的益生元实验显示，XOSWS可选择性刺激双歧杆菌属（Bifidobacterium）和魏斯氏菌属（Weissella），而乳杆菌属（Lactobacillus）菌株未见生长。XOSWS表现出浓度依赖的抗氧化活性，且在THP-1、RAW 264.7和3T3-L1细胞系中无细胞毒性效应。此外，免疫调节效应体现为免疫细胞中介导炎症细胞因子表达下调以及对核因子κB（NF-κB）信号通路的调控。本工作的新颖性在于对小麦秸秆来源XOS进行了集成功能评价，该来源在生物活性方面此前很大程度上未被探索。总体而言，这些发现凸显了小麦秸秆XOS作为可持续、高附加值的营养药理（nutraceutical）成分的潜力，支持了农业残渣的高值化利用。

研究背景：益生元（prebiotic）是指不被宿主消化的食品组分，通过选择性刺激胃肠道有益微生物（主要是双歧杆菌属Bifidobacterium和乳杆菌属Lactobacillus）来促进宿主健康，进而产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）以改善消化与免疫功能。目前已广泛研究并应用的益生元主要包括半乳寡糖（galactooligosaccharides，GOS）、果寡糖（fructooligosaccharides，FOS）、寡果糖和低聚菊糖（inulin）等。木寡糖（xylooligosaccharides，XOS）是由β-D-木吡喃糖基单元通过β-(1,4)-木糖苷键连接而成的糖类寡聚物，其中聚合度（degree of polymerization，DP）为2至6的XOS具有最高的益生元潜力。XOS来源于植物细胞壁半纤维素主要组分木聚糖（xylan）的水解，其DP、取代模式、分支情况以及乙酰或阿拉伯糖基等取代基的结构特征会影响其对特定微生物转运蛋白和碳水化合物降解酶的可及性，从而选择性刺激不同细菌种群，导致发酵谱和代谢产物（包括SCFAs）的差异，进而影响健康结局。现有研究大多集中于玉米芯来源的XOS（欧洲食品安全局EFSA目前仅批准玉米芯来源XOS用于人类食用），而小麦秸秆作为极丰富的农业副产物和木质纤维素原料，其衍生XOS的结构-功能关系尤其是生物活性（益生元、抗氧化、免疫调节）尚未得到充分研究。为此，研究人员以小麦秸秆为原料，经碱预处理结合内切-1,4-木聚糖酶酶水解制备XOS富集粉末（XOS_WS），系统表征其组成与结构，并在体外评估其小肠消化稳定性、抗氧化能力、哺乳动物细胞毒性、对益生菌株的选择性生长促进作用，以及对免疫细胞炎症相关基因表达、一氧化氮（nitric oxide，NO）产生和NF-κB通路激活的免疫调节作用。该研究发表于《Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre》，对农业残渣高值化及新型功能性低聚糖开发具有重要意义。

主要关键技术方法：研究人员采用的核心方法包括：以西班牙本地小麦秸秆为原料，经NaOH碱预处理、高温高压蒸煮后使用商业化内切-1,4-木聚糖酶（Pentopan Mono Conc?）水解制备XOS_WS，透过1 kDa截留分子量（MWCO）超滤膜获取渗透组分并冻干；采用高效液相色谱（HPLC）搭配示差折光检测器（RID）和紫外（UV）检测器定性定量XOS各DP组分及取代基（阿拉伯糖、糖醛酸、乙酸、阿魏酸、对香豆酸），采用Rezex RNO-Oligosaccharide Na⁺柱分析XOS与阿拉伯木寡糖（arabinoxylan oligosaccharides，AXOS），采用Transgenomic ICSep ION-300柱分析单体和酸水解产物，采用Luna C18柱分析酚酸；采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）鉴别官能团；采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析DP分布与乙酰化取代；采用大鼠小肠提取物（RSIE）模拟体外小肠消化2小时，通过HPLC-RID监测XOS残留比例；采用DPPH自由基清除实验评估抗氧化活性并计算IC₅₀；采用Alamar Blue法检测XOS_WS在THP-1 Blue NF-κB人单核细胞、RAW 264.7小鼠巨噬细胞、3T3-L1小鼠前脂肪细胞及Caco-2人肠上皮细胞中的细胞活力；采用单一菌株培养（MRS基础培养基中以XOS_WS为唯一碳源）评估对Lactobacillus、Lacticaseibacillus、Lactiplantibacillus、Lactilactobacillus、Weissella、Bifidobacterium等菌株的选择性促生长效应；采用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7炎症模型，通过RT-qPCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达（内参GAPDH），采用Griess试剂检测培养上清NO（亚硝酸盐当量）；采用THP1-Blue?-NF-κB细胞经LPS刺激后QUANTI-Blue?法检测分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）活性以反映NF-κB转录激活水平，并以按比例混合的标准XOS为对照。

研究结果：

3.1 XOS_WS的得率与阿拉伯木聚糖来源XOS组成：研究人员通过HPLC-RID表征发现XOS_WS中阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）纯度为65.0±1.4%（650.7±14.6 mg/g粉末），AX组分含中等程度取代：阿拉伯糖（74.9±2.5 mg/g AX）、阿魏酸（1.11±0.02 mg/g AX）、对香豆酸（0.76±0.03 mg/g AX）。DP≤6的低DP XOS占粉末的453.0±4.4 mg/g（占检测AX的69.6%），以木二糖（xylobiose，X₂）为主（258.9±7.0 mg/g粉末，占AX的39.8%），其次为木五糖（xylopentaose，X₅）（108.1±6.7 mg/g粉末，16.6%）和木三糖（xylotriose，X₃）（44.2±1.2 mg/g粉末，6.8%）；木六糖（xylohexose，X₆）和木四糖（xylotetraose，X₄）较少（分别为32.1±1.6和9.7±1.7 mg/g粉末，占AX的4.9%和1.5%）。DP>6的高DP XOS占82.7 mg/g粉末（占AX的12.7%）。可检测标准范围内未检出阿拉伯木寡糖（AXOS：A³X、A²XX、A^2,3XX），提示低DP XOS主要为线性低分支结构。游离木糖（无益生元活性）占AX的17.7%（115.0±4.3 mg/g粉末）。MALDI-TOF-MS确认了DP2–DP6未分支XOS及最长至DP12的线性XOS，DP≥6的寡聚物可见乙酰化取代信号（[Xyl_nKAc]⁺等），FTIR光谱在896 cm^-1处显示典型β-(1→4)糖苷键特征，1155 cm^-1附近提示阿拉伯糖含量，1419、1379、1246 cm^-1分别对应C–O伸缩、乙酰基和COO^–不对称振动，整体与木聚糖来源寡糖结构一致，证实产物含特征官能团及适度取代。

3.2 哺乳动物细胞在XOS_WS存在下的活力（Alamar Blue实验）：研究人员发现，在50、100、200 μg/mL浓度下，XOS_WS未引起THP-1、RAW 264.7、3T3-L1、Caco-2细胞活力显著下降（p>0.05）；除THP-1在50 μg/mL时活力略降至96.5%（不显著）外，多数条件下活力值≥100%（部分达显著），提示无细胞毒性，且在部分细胞系中可能存在代谢激活或增殖倾向，支持其生物相容性。

3.3 XOS_WS的体外消化稳定性（RSIE模拟小肠消化）：研究人员测定RSIE蛋白含量3.6% w/w，麦芽糖酶（maltase）活性19.6±1.74 U（μmol min^–1g^–1），β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性41.0±2.28 U。经2小时消化后，X₂残留80.5%（消化19.5%），X₃残留93.2%（消化6.8%），X₅残留91.0%（消化9.0%），X₆残留86.2%（消化13.9%）；X₄表现为“残留433.8%”（即相对增加），源于更高DP XOS或AXOS在消化中部分水解生成X₄，而X₄本身在低DP XOS中原丰度最低，使相对百分比异常。总体上≥80%的DP2–6 XOS保持完整，说明其抗小肠酶解，可抵达结肠发挥功能；但本研究消化实验仅为双复孔，统计功效有限。

3.4 XOS_WS的抗氧化能力（DPPH法）：研究人员观察到XOS_WS对DPPH自由基清除率呈浓度依赖性，0.2 mg/mL时为21.3%，3 mg/mL时达83%，IC₅₀为0.67 mg/mL。其抗氧化可能来自XOS羟基供氢/电子能力，以及共存微量阿魏酸、对香豆酸（已知抗氧化剂）的贡献；与文献比较，该IC₅₀优于菊粉（inulin，约6 mg/mL）、接近小麦麸FOS（0.7 mg/mL），略优于芽孢杆菌来源玉米芯XOS（1 mg/mL），显示较好抗氧化潜力。

3.5 益生菌株在XOS_WS为唯一碳源下的生长：研究人员测试多株菌发现，所有Lactobacillus（acidophilus CECT903、gasseri CECT4479/8109、Lacticaseibacillus rhamnosus CECT278、L. casei CECT475、Lactiplantibacillus plantarum DSM9843、Lactilactobacillus sakei CECT906、Lactobacillus helveticus CECT4305）均不生长；Weissella confusa CECT4707和Weissella koreensis CECT7110可生长（OD₆₀₀显著大于空白，pH下降）；Bifidobacterium中adolescentis CECT5781、longum CECT503、catenulatum CECT7362可生长（OD显著升高，pH降低），而bifidum CECT870、breve CECT4839、longum CECT551不生长。生长菌的OD值均低于葡萄糖阳性对照，说明XOS利用效率低于葡萄糖（需诱导β-木糖苷酶及转运蛋白）。该选择性谱（促Bifidobacterium和Weissella，不促Lactobacillus）区别于FOS（主要促Lactobacillus），且与XOS_WS结构（低DP以X₂、X₅为主，适度取代）相关。

3.6 XOS_WS的免疫调节生物活性：3.6.1 炎症相关基因表达（RT-qPCR，RAW264.7）：研究人员发现，LPS（100 ng/mL）诱导炎症模型中，XOS_WS（50、100、200 μg/mL）未显著改变IL-1β表达，但显著降低TNF-α（50、100 μg/mL显著）和IL-6（三个浓度均显著）的mRNA水平；在无LPS刺激下，XOS_WS200 μg/mL单独即显著降低基础IL-1β（fold change 0.72，p<0.001）和TNF-α（0.59，p<0.01）表达，提示本身具抗炎倾向。3.6.2 NO产生（Griess法）：XOS_WS单独或与LPS（1 μg/mL）共处理均未显著改变RAW264.7的NO（亚硝酸盐）释放，即不影响诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导NO产生。3.6.3 NF-κB通路激活（THP1-Blue? NF-κB SEAP报告系统）：研究人员观察到LPS（1 ng/mL）显著激活NF-κB（SEAP升高）；先孵育XOS_WS（50–200 μg/mL）24小时再加LPS，XOS_WS进一步提升SEAP活性（即增强NF-κB转录激活），而同比例标准XOS混合物（DP2–6按XOS_WS比例配制）与LPS共处理无此增强效应。说明XOS_WS中其他组分（DP>6 XOS、乙酰化/酚酸取代、微量杂质）可能影响NF-κB通路；尽管NF-κB转录活性上升，但炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA反而下调，提示可能触发负反馈调节（如诱导IκBα、A20、IL-10等），使转录输出偏向非炎性或抗炎谱。

讨论总结：研究人员在讨论中指出，小麦秸秆这类丰富农业副产物可有效高值转化为富含低DP XOS（尤其X₂、X₅）的粉末，结构表征（HPLC-RID、MALDI-TOF-MS、FTIR）确认产物以线性低DP XOS为主，伴适度取代（阿拉伯糖、乙酰基、阿魏酸、对香豆酸）及DP>6组分。体外小肠消化显示≥80% DP2–6 XOS抗酶解，可抵达结肠；DPPH实验表明浓度依赖抗氧化（IC₅₀0.67 mg/mL），优于菊粉、可比于部分FOS；Alamar Blue证实在哺乳动物细胞系无毒性，部分浓度甚至倾向提升活力；益生元筛选显示选择性促进Bifidobacterium（adolescentis、longum CECT503、catenulatum）和Weissella（confusa、koreensis），不促进测试的Lactobacillus，符合XOS结构选择性；免疫实验发现XOS_WS本身或在LPS模型中降低TNF-α、IL-6（有时IL-1β）基因表达，但不影响NO产生，且XOS_WS与LPS共处理增强NF-κB报告活性（标准XOS无此效应），提示复杂组分可能激活NF-κB但同时通过负调控使炎性细胞因子转录受抑，体现选择性免疫调节而非单纯抑制或激活。结论部分明确：小麦秸秆衍生XOS_WS具备益生元潜力（抗消化、选择性益生活性）、浓度依赖抗氧化、无哺乳动物细胞毒性、选择性免疫调节（下调部分促炎细胞因子）；该研究集成功能评价填补了小麦秸秆XOS生物活性研究的不足，支持农业木质纤维素残渣在循环生物经济框架下转化为多功能生物活性碳水化合物（益生元、抗氧化、免疫调节），适用于功能性食品或营养药理成分；但本研究仅为体外实验，无法复现体内胃肠动态消化、宿主– microbiota互作及整体免疫应答，未来需动态结肠发酵系统、动物模型及人体临床试验来验证生理相关性与安全性。