《Methods and Protocols》：Methodological Framework for a Multimodal Rat Model of Bleomycin-Induced Fibrosis and Autologous Tissue Grafting
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可重复的局限性皮肤-皮下纤维化实验模型对于再生干预措施的标准化研究至关重要。然而，博来霉素（Bleomycin）给药剂量、解剖学定位以及评估策略的差异性限制了跨研究的可比性。本研究描述了一种方法学框架，用于在大鼠模型中标准化诱导早期皮肤-皮下重塑，继而进行自体
可重复的局限性皮肤-皮下纤维化实验模型对于再生干预措施的标准化研究至关重要。然而，博来霉素（Bleomycin）给药剂量、解剖学定位以及评估策略的差异性限制了跨研究的可比性。本研究描述了一种方法学框架，用于在大鼠模型中标准化诱导早期皮肤-皮下重塑，继而进行自体皮下组织移植及多模式纵向评估。研究人员对雌性Wistar大鼠进行皮下博来霉素给药，剂量为1 mg/kg/天，连续3天。在基线、中期再评估及最终评估时，于 predefined（预定义的）前胸解剖位点进行临床记录、固定成像参数的高频超声检查以及序贯活检。自体皮下组织移植于研究开始后第17天进行。该方案实现了早期结构性重塑的受控诱导，并在标准化解剖区域内对皮肤-皮下厚度、回声变化及组织学结构进行了稳定的纵向记录。此项方案开发研究建立了一个可重复且空间上一致的实验平台，整合了影像学和组织学评估，为未来纤维化重塑及再生策略的假设驱动型研究奠定了基础。
皮肤及皮下纤维化以细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）进行性沉积、结构扭曲及组织顺应性降低为特征。在重建外科领域，特别是放疗后，皮肤-皮下重塑会改变组织质量及血管化程度，增加移植整合与手术规划的难度。因此，可靠的临床前模型对于探究纤维化重塑机制及评估再生策略具有重要价值。博来霉素诱导的皮肤纤维化模型因其能够可重复地触发局限性炎症激活及后续细胞外基质沉积，已成为啮齿类动物研究中广泛应用的模型。然而，现有研究在给药方案、解剖学定位、采样策略及影像学方法等方面存在显著差异，导致跨研究可比性和可重复性受限。能够整合影像学和组织学评估且在同一解剖区域内进行的标准化多模式框架仍显不足。
本研究旨在建立一种结构化的方法学框架，采用亚最大剂量博来霉素方案受控诱导早期皮肤-皮下重塑，继而进行自体皮下组织移植及纵向多模式评估，以期构建一个强调解剖学一致性、操作标准化及整合性结构评估的可重复实验平台。该方案得到了既往使用相同实验框架获得的影像学、临床及组织学数据的支持，证实了其产生可重复且可量化重塑模式的能力。
研究人员设计了包含四个序贯实验阶段的方案。第一阶段为基线多模式评估，包括标准化临床摄影、固定成像参数的高频超声检查以及从前胸预定位点进行Tru-Cut活检；第二阶段通过连续3天皮下注射博来霉素（1 mg/kg/天）诱导早期皮肤-皮下重塑；第三阶段于博来霉素给药完成后第14天进行中期再评估和手术干预，包括重复影像学检查、活检、腹股沟脂肪组织获取、机械处理及皮下移植；第四阶段于第31天进行最终评估，包括标准化影像学和全层切除活检，随后实施安乐死。
实验采用22只16周龄、体重250–300 g的雌性Wistar大鼠，分配至治疗组（n=15，最终纳入纵向分析13只）、纤维化对照组（n=5）和健康参考组（n=2）。所有操作由单一经验丰富的操作者完成，以最小化操作者间变异。高频超声采用Vscan Air?便携式超声系统（12 MHz线阵探头），成像参数固定不变。组织学标本经10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋、4 μm切片后进行苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色，由盲法研究者进行定性评估，重点关注胶原纤维束组织与密度、真皮增厚、炎症浸润、血管变化及皮下组织结构完整性。
研究结果显示，该方案成功实现了早期皮肤-皮下重塑的受控诱导。超声评估显示，基线时真皮-皮下结构保留，皮下呈均匀低回声层伴纤细回声分隔；第17天可见回声增强、间隔增厚及结构均匀性降低，与早期纤维化重塑一致；第31天部分区域回声减低、间隔突起减弱，伴局灶性低回声区，对应移植组织整合。组织学检查证实，第17天可见胶原沉积增加、结缔组织间隔增厚、脂肪细胞变形及血管扩张；第31天呈现异质性组织结构，可见存活脂肪组织、纤维化间隔及脂肪细胞变性区域共存。临床评估方面，综合评分（包括红斑、水肿、组织弹性及活动度）从基线0分升至博来霉素暴露后的9.28±1.75分，移植后降至7.50±1.35分，提示部分功能改善。半定量超声评分从基线0分升至第17天约2.15±0.58分，移植后降至约1.50±0.50分；真皮厚度从基线约0.94 mm增至第17天1.39 mm，移植后有所下降。
在讨论部分，研究人员进一步阐述了方案设计的理论基础。选择博来霉素是由于其在啮齿类模型中可重复诱导局限性皮肤及皮下纤维化重塑的能力。与经典方案追求致密硬化性纤维化不同，本研究有意采用亚最大剂量方案（1 mg/kg/天×3天），旨在启动受控的促纤维化信号及早期细胞外基质沉积，而不进展为晚期终末纤维化。博来霉素末次给药至手术干预间隔14天的设计，允许组织从急性炎症反应向早期结构重塑过渡，为评估移植组织在活跃重塑环境中的整合提供了稳定但非终末期的纤维化基质。
该多模式纵向评估框架的主要优势在于整合了标准化临床记录、高频超声及序贯组织学采样，在保持空间一致性的同时实现了纵向结构评估。高频超声可在固定成像参数和恒定解剖标志下重复测量皮肤-皮下厚度并定性评估组织回声特性；同一预定义前胸位点的序贯活检确保了组织学评估的时间连续性。这种非侵入性影像学与受控组织采样相结合的方式，使得研究人员能够在不依赖终末终点的情况下进行性监测结构重塑。
研究人员也客观分析了方法的局限性：该模型旨在诱导早期皮肤-皮下重塑而非晚期致密纤维化，因此不能复现慢性放射诱导瘢痕的全部结构复杂性；同一解剖区域的序贯活检虽增强纵向可比性，但可能引起轻微的程序性组织改变；组织学评估限于H&E染色，聚焦结构评估而非定量胶原形态计量学或分子表征；健康参考组样本量有限，限制了生理性变异的全面捕捉；单物种、受控临床前环境的设定要求向复杂人类纤维化条件外推时需谨慎。
研究结论表明，该方案建立了一个可重复且空间一致的实验平台，整合了影像学和组织学评估，能够标准化诱导早期皮肤-皮下重塑并记录自体组织移植后的结构动态变化。该框架为未来纤维化重塑及再生策略的假设驱动型研究提供了方法学基础，尤其适用于探索早期纤维化环境中移植组织整合机制的研究场景。
