《Methods and Protocols》：Regulated Cell Death in Fungi, the Role of Metacaspases and Assay Techniques
半胱天冬酶在后生动物细胞凋亡中起核心编排作用，调控胚胎发生、衰老细胞与受感染细胞的清除以及免疫耐受等过程。研究人员已在细菌、植物、原生生物和真菌中鉴定出半胱天冬酶的结构同源物，并在这些生物中证实存在调控性细胞死亡（regulated cell death，RCD）。这一发现促使部分研究者提出，真菌后胱天蛋白酶（metacaspase）可能执行与半胱天冬酶相似的功能。本文综述了调控性细胞死亡，首先概述RCD及半胱天冬酶在哺乳动物RCD中的核心作用；随后列举真菌中RCD的实例，比对半胱天冬酶同源物的结构与活性，并概述真菌中依赖后胱天蛋白酶与非依赖后胱天蛋白酶的细胞死亡实例，重点关注酿酒酵母（S. cerevisiae）。最后，文章讨论“后胱天蛋白酶是否属于半胱天冬酶”这一问题，识别替代性细胞死亡蛋白酶，并提出未来研究目标。
1. Introduction
本文首先界定了细胞凋亡作为调控性细胞死亡（regulated cell death，RCD）的经典形式，在哺乳动物发育、免疫细胞正负选择以及衰老细胞更新中的基础作用。文中指出，细胞凋亡通过遗传编码的保守通路维持组织稳态，而其失衡可导致肿瘤或炎症。随着在真菌、植物、原生生物甚至部分原核生物中发现半胱天冬酶结构同源物，研究界一度推测凋亡机制可能在生命树中广泛保守。基于此，文章提出本综述的核心任务：一方面梳理哺乳动物RCD及其检测技术，另一方面重点讨论真菌RCD、后胱天蛋白酶及“后胱天蛋白酶是否等同于半胱天冬酶”的争议。
2. Characterization of Mammalian Apoptosis
2.1. Physiological Changes During Apoptosis
文章总结了哺乳动物细胞凋亡的典型形态学与生理学特征，包括质膜（plasma membrane，PM）起泡、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻、线粒体膜电位下降、细胞皱缩、染色质凝聚、DNA断裂及凋亡小体形成。这些变化使细胞内容物被吞噬细胞及时清除，从而避免炎症扩散。作者同时将其与坏死进行区分，指出坏死更多表现为细胞和细胞器肿胀、膜破裂以及缺乏有序DNA断裂。
2.2. Detecting Apoptosis
本节概述了凋亡检测的标准技术体系，包括光学与电子显微镜观察细胞皱缩、膜起泡和凋亡小体，利用DAPI或Hoechst染色观察染色质凝聚，采用流式细胞术或凝胶电泳分析DNA断裂，以及通过膜联蛋白V（annexin V）检测PS外翻。文中重点介绍了TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）染色，通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）标记DNA断裂暴露的3′-OH末端，从而可视化DNA链损伤。这些方法构成后续真菌RCD分析的重要参照框架。
2.3. Mammalian Caspases
作者系统说明了半胱天冬酶（caspase）的分子特征，即具有保守半胱氨酸/组氨酸催化二联体的半胱氨酸依赖性天冬氨酸特异性蛋白酶。炎症性半胱天冬酶与凋亡性半胱天冬酶在功能上分化明显，后者又包括起始型与执行型两类。起始型半胱天冬酶通过蛋白互作结构域被激活，进一步切割并激活执行型半胱天冬酶；执行型半胱天冬酶再切割下游底物，推动细胞进入凋亡程序。该部分为后文比较真菌后胱天蛋白酶与动物半胱天冬酶的异同奠定了概念基础。
2.4. Apoptosis Pathways
2.5. Extrinsic Apoptosis and the DISC
2.6. Intrinsic Apoptosis and the Apoptosome
2.7. Other Forms of Cell Death in Mammals
文章进一步概述了外源性与内源性凋亡通路。外源性通路依赖死亡配体、死亡受体及死亡诱导信号复合体（death-inducing signaling complex，DISC）；内源性通路则由线粒体外膜通透化（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP）、细胞色素c释放及凋亡小体（apoptosome）形成所驱动。除此之外，作者还简述了焦亡（pyroptosis）、铁死亡（ferroptosis）、程序性坏死（necroptosis）、自噬性死亡等多种哺乳动物RCD形式，意在说明“RCD”并不等同于“凋亡”，从而为重新定义真菌细胞死亡形式提供理论背景。
3. Regulated Cell Death in Fungi
3.1. Why Should Fungi Undergo Regulated Cell Death?
本节讨论单细胞或简单多细胞真菌为何会进化出RCD。作者强调，若个体死亡能使近缘个体获得营养、减少不相容个体、限制病毒传播或促进群体适应，则RCD具有群体层面的选择优势。此外，部分理论认为真核RCD机制可能源于古老内共生关系中的宿主—共生体冲突与协调，提示真菌细胞死亡机制可能兼具古老起源与功能多样性。
3.2. Early Examples of RCD in Fungi
作者回顾了真菌RCD的早期证据，包括代谢失衡导致的“非平衡生长”、异核体不亲和性（heterokaryon incompatibility，HI）、子囊孢子败育以及子实体发育中的细胞清除。尤其在HI中，不相容菌丝融合后诱发液泡裂解、DNA损伤、细胞质收缩等现象，并与非己识别及免疫样反应相联系。文章还指出，某些真菌gasdermin样蛋白及NOD样受体（NOD-like receptor，NLR）相关通路，可能使真菌RCD在机制上更接近哺乳动物焦亡或坏死性程序，而不必然对应经典凋亡。
3.3. RCD in Saccharomyces cerevisiae
本节是全文重点之一，系统汇总了酿酒酵母（S. cerevisiae）中多种RCD诱导情境。作者讨论了酵母杀手毒素、糖诱导细胞死亡、cdc48
S565G突变、异源表达Bax、氧化应激、乙酸、渗透素、衰老、信息素以及多种化学与环境刺激所引发的细胞死亡。不同刺激下可见PS外翻、DNA断裂、染色质凝聚、活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累、线粒体功能紊乱和膜完整性丧失等表型，但这些表型并不总是指向同一种死亡机制。作者特别强调，低剂量应激常诱发具有“凋亡样”特征的RCD，而高剂量刺激则更倾向于原发性坏死；同时，蛋白新生依赖性、线粒体参与程度以及ROS作用也因情境而异，说明酵母RCD高度异质。
3.4. RCD in Schizosaccharomyces pombe
在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中，Bax或Bak表达、脂质代谢缺陷、DNA复制起始异常、肌醇饥饿及时间性衰老均可诱发RCD。其表型包括液泡化、DNA凝聚、核膜解体、PS外翻和ROS积累等。作者借此说明，不同酵母模型共享若干RCD表征，但分子调控网络并不完全一致。
3.5. RCD in Human Fungal Pathogens
3.6. RCD in Plant Fungal Pathogens
文章随后扩展至病原真菌，指出白色念珠菌（Candida albicans）、曲霉属（Aspergillus）、新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）和荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）等在乙酸、H
2O
2、两性霉素B、棘白菌素、法呢醇及放射免疫治疗等刺激下，均可出现RCD。植物病原真菌如Colletotrichum spp.和Fusarium oxysporum也表现出类似现象。作者据此说明，RCD不仅存在于模式真菌，而且与抗真菌药物作用、毒力控制及生态适应密切相关。
4. Caspase Orthologs and Other Death Protein Orthologs
本部分聚焦真菌中与后生动物死亡蛋白相关的同源物，包括后胱天蛋白酶（metacaspase）、细胞色素c、凋亡诱导因子同源蛋白、凋亡抑制蛋白同源物及Omi/HtrA2同源蛋白。作者指出，这些蛋白的存在支持RCD效应因子在进化上的广泛保守性，但“结构同源”并不意味着“功能等同”。
4.1. Discovery of Metacaspases, Paracaspases and Orthocaspases
4.2. Structure of Caspase Orthologs
4.3. Mechanism of Metacaspase Activity
作者回顾了通过BLAST比对发现后胱天蛋白酶（metacaspase）、旁胱天蛋白酶（paracaspase）和直系胱天蛋白酶样蛋白（orthocaspase）的历程，并比较了不同家族成员的结构域组织。文章强调，后胱天蛋白酶虽与半胱天冬酶同属Clan CD、Family C14蛋白酶，但其底物P1位点偏好精氨酸或赖氨酸，而非天冬氨酸；同时，多数后胱天蛋白酶依赖Ca
2+激活，而非通过近邻诱导聚集活化。这一结构—功能差异是全文论证“后胱天蛋白酶并非半胱天冬酶”的关键依据。
4.4. Metacaspase-Dependent RCD in Fungi
作者列举了若干依赖后胱天蛋白酶的真菌RCD实例，包括时间性衰老、杀手毒素、高渗胁迫、法呢醇以及部分抗真菌药物或金属离子诱导的细胞死亡。在这些研究中，Mca1p常与细胞死亡进程、ROS积累及所谓“caspase-like activity”升高相关。然而作者指出，许多实验依赖FITC-VAD-fmk、D
2R等针对半胱天冬酶或天冬氨酸切割活性的探针，因此并不能直接证明检测到的活性来源于后胱天蛋白酶本身。
4.5. Metacaspase-Independent RCD
与此相对，文章总结了大量非依赖后胱天蛋白酶的RCD实例，如鞘脂诱导死亡、菌落中心细胞的利他性死亡、抗菌肽、乙酸、金属、甲酸及卡泊芬净诱导的死亡等。这些结果表明，真菌RCD并不存在单一核心执行蛋白，至少在酿酒酵母中，Mca1p只是若干可能参与者之一。
4.6. Non-Cell Death Roles of Yeast Metacaspase
作者进一步指出，Mca1p并非专职“死亡蛋白酶”，其还参与蛋白聚集体清除、蛋白稳态维持以及细胞周期调控。这种多功能性与动物执行型半胱天冬酶的高度专门化形成鲜明对比，也削弱了将后胱天蛋白酶直接视作“真菌半胱天冬酶”的合理性。
5. The Debate
5.1. Are Metacaspases Caspases?
5.2. Metacaspases Are Caspases, Doubt No More
5.3. Metacaspases Are Not Caspases—Always Doubt
本节集中呈现学术争论。支持者认为，尽管后胱天蛋白酶与半胱天冬酶切割位点不同，但二者可能作用于保守细胞死亡网络中的相似底物；反对者则强调，半胱天冬酶的定义本身就要求其为“天冬氨酸特异性”蛋白酶，因此后胱天蛋白酶在定义上即被排除在外。作者综合双方观点后倾向认为：后胱天蛋白酶与半胱天冬酶在进化和结构上相关，但在底物特异性、激活机制及生物学功能上存在本质差异，不宜混同。
6. Assay Methods for Detecting Fungal RCD
本部分系统总结真菌RCD检测方法。文章依次讨论存活性测定、活力测定、细胞核与DNA检测、ROS与线粒体检测、质膜变化检测以及标准方法存在的问题。由于真菌存在细胞壁，annexin V染色、膜起泡观察和某些荧光探针实验往往需要原生质体化处理，这可能引入伪影。作者指出，CFU、PI染色、DAPI、TUNEL、ROS探针和线粒体膜电位检测各有局限，单一指标不足以界定死亡类型，需联合多指标判断原发性坏死、继发性坏死与RCD。尤其值得强调的是，以合成半胱天冬酶底物或抑制剂推断后胱天蛋白酶活性存在较高假阳性率，因此作者主张采用更适合精氨酸/赖氨酸P1特异性的底物与抑制剂，并发展新一代后胱天蛋白酶抑制工具。
7. Alternative Cell Death Proteases in Yeast
文章最后将视角扩展至替代性死亡蛋白酶，认为真菌中检测到的“caspase-like”或“aspartase”活性，未必来自Mca1p。作者综述了Esp1p、Nma111p、Kex1p、Pep4p、蛋白酶体以及Yps7p、Aap1p、Pim1p、Lap2p、Map1p、Rbd2p等候选蛋白酶在RCD中的潜在作用。这些蛋白有的直接促进死亡，有的通过线粒体损伤、蛋白水解、氧化应激或液泡功能间接影响RCD，也有部分兼具促存活作用。该部分突出了真菌RCD蛋白水解网络的复杂性，提示未来需结合基因缺失、特异性抑制剂和降解组学（degradomics）解析真实执行因子。
8. Defining Regulated Cell Death
作者主张避免将真菌细胞死亡简单称为“凋亡”或“凋亡样死亡”，因为现代凋亡定义包含执行型半胱天冬酶，而真菌并不具有此类蛋白。文章建议依据调控机制和表型证据，将真菌死亡区分为RCD、调控性坏死、自噬依赖性细胞死亡和意外坏死等类型。同时，作者提出异核体不亲和等真菌RCD在某些方面可能更接近哺乳动物焦亡或坏死性程序，尤其当孔形成蛋白和非己识别系统参与时更是如此。
9. Conclusions and Recommendations
结论部分明确指出：至少部分后胱天蛋白酶参与真菌RCD，但它们不是半胱天冬酶。未来研究的重点应包括开发并应用后胱天蛋白酶特异性底物和抑制剂、解析真菌后胱天蛋白酶降解组、阐明不同RCD模型的调控通路，并系统鉴定后胱天蛋白酶非依赖性死亡中的关键蛋白酶。作者还强调，应更多考虑真菌RCD是否更接近焦亡等其他死亡形式，而非默认与哺乳动物凋亡同构。整体而言，本文从进化、结构、生化特异性和方法学四个层面，对真菌RCD研究中的核心争议与技术瓶颈进行了全面梳理。
