PM2.5通过DRP1/PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬激活促铁死亡信号促进动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞表型转化

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：PM2.5 promotes the phenotypic transition of vascular smooth muscle cells in atherosclerosis by activating pro-ferroptotic signaling via DRP1/PINK1/Parkin-dependent mitophagy

　　

可吸入细颗粒物（PM2.5)作为一种广泛存在的环境污染物，与心血管疾病密切相关。PM2.5对心血管系统的不良影响及其加重动脉粥样硬化的分子机制尚不完全清楚。本研究通过建立体内外PM2.5暴露模型探究相关致病机制。将雄性ApoE^-/-小鼠随机分为三组：过滤空气(FA)组、未过滤空气(UA)组和PM2.5浓缩空气(CA)组。体外实验中，小鼠主动脉血管平滑肌细胞分别以0、25、50和100 μg/ml浓度暴露于PM2.5，同时设立对照组，采用DRP1抑制剂Mdivi-1和铁死亡抑制剂Fer-1进行干预，并构建PINK1敲低细胞模型。暴露后通过超声心动图评估主动脉血管功能。动脉组织和细胞中的组织病理学改变、胶原沉积和脂质积累分别通过苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色、油红O和BODIPY染色进行评估。免疫荧光和蛋白质印迹法(Western blot)用于分析动脉壁中相关蛋白的表达。结果表明，PM2.5暴露加速动脉粥样硬化进展和血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化。PM2.5暴露上调线粒体分裂蛋白并下调融合蛋白，其中DRP-1为关键调控分子。PM2.5特异性激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬而非FUNDC1通路。PINK1敲低显著减弱促铁死亡信号。Mdivi-1干预缓解PM2.5诱导的过度线粒体自噬、上调促铁死亡信号及VSMC表型转化。Fer-1处理亦有效抑制VSMC表型转化。本研究结果证实，在PM2.5加重动脉粥样硬化过程中，DRP1驱动的PINK1/Parkin介导线粒体自噬通过诱导促铁死亡信号促进VSMC表型转化，这些发现为环境相关性动脉粥样硬化的发病机制及治疗干预靶点提供了新见解。

本研究围绕PM2.5暴露加重动脉粥样硬化的分子机制展开，发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》。动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病的首要病理特征和病理生理学基础，其加速进展及易损斑块破裂风险增加除传统危险因素外，环境空气污染物PM2.5近年被确认为新的促动脉粥样硬化因素。血管平滑肌细胞（VSMC）是动脉粥样硬化斑块中最丰富的细胞类型，其表型转化即从分化收缩型向增殖、迁移和合成型转变是动脉粥样硬化发生发展的关键环节。线粒体动力学失衡与VSMC表型转化密切相关，但PM2.5对VSMC线粒体功能的影响尚不清楚。研究人员基于此科学问题，旨在探究PM2.5通过DRP1/PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬激活促铁死亡信号驱动VSMC表型转化的机制。

研究采用的核心技术方法包括：体内实验建立ApoE^-/-小鼠PM2.5全身暴露模型（FA、UA、CA三组，暴露16周），通过超声心动图检测脉搏波传导速度(PWV)评估血管功能；组织学分析采用HE染色、油红O染色、Masson染色及免疫荧光检测；体外采用小鼠主动脉血管平滑肌细胞(MOVAS)建立PM2.5暴露模型（0-100 μg/ml），结合DRP1抑制剂Mdivi-1、铁死亡抑制剂Fer-1干预及PINK1 siRNA敲低；线粒体功能检测包括MitoSOX Red探针线粒体活性氧(mtROS)、JC-1探针线粒体膜电位、ATP检测试剂盒及Western blot检测线粒体动力学相关蛋白；线粒体自噬检测通过Western blot分析PINK1、Parkin、LC3Ⅰ/Ⅱ、p62及FUNDC1表达；铁死亡相关指标采用RhoNOX-1探针检测Fe²⁺、BODIPY 581/591 C11检测脂质过氧化、DCFH-DA探针检测活性氧(ROS)、硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)，以及Western blot检测CD71、GPX4等蛋白表达。

PM2.5暴露加速动脉粥样硬化发展：研究结果显示，PM2.5暴露16周后，CA组主动脉根部斑块面积显著大于FA组，脉搏波传导速度升高提示血管僵硬度增加；冠状动脉油红O染色和BODIPY免疫染色显示CA组动脉粥样硬化面积显著增大；HE染色显示CA组坏死核心面积显著增加，证实PM2.5暴露促进动脉粥样硬化发展。

PM2.5暴露诱导MOVAS表型转化：免疫荧光显示CA组小鼠主动脉α-SMA标记的平滑肌细胞中骨桥蛋白(OPN)表达显著增加；体外Western blot显示100 μg/ml PM2.5组基质金属蛋白酶9(MMP9)升高而α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)降低，OPN免疫荧光增强，细胞迁移实验显示增殖能力增加，表明PM2.5暴露诱导MOVAS从收缩型向合成型转化。

PM2.5暴露介导线粒体稳态失衡和PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬：PM2.5暴露导致主动脉VSMC中分裂相关蛋白DRP-1和FIS1表达增加，融合相关蛋白MFN1和OPA1表达减少；MOVAS中DRP-1显著增加而MFN1减少，线粒体膜电位下降，mtROS增加，ATP含量降低。线粒体自噬检测发现FUNDC1蛋白无显著变化，而PINK1、Parkin、p62和LC3Ⅰ/Ⅱ显著上调，表明PM2.5主要通过PINK1/Parkin泛素化线粒体自噬通路而非FUNDC1通路诱导线粒体自噬。

DRP-1抑制逆转PM2.5诱导的线粒体自噬和表型转化：Mdivi-1处理显著提高线粒体膜电位，降低mtROS，部分恢复ATP水平；Western blot显示PINK1、Parkin、p62和LC3Ⅰ/Ⅱ表达降低而FUNDC1无变化；OPN荧光强度降低，MMP9减少而α-SMA增加，细胞增殖下降，证实DRP-1特异性激活PINK1/Parkin线粒体自噬通路并促进表型转化。

PM2.5暴露诱导促铁死亡信号：PM2.5暴露后主动脉VSMC中CD71表达增加而GPX4减少；MOVAS中Fe²⁺含量增加，脂质过氧化、ROS和MDA水平升高，CD71上调而GPX4下调，VDAC1无显著变化，表明PM2.5诱导促铁死亡信号而非完全铁死亡。

Fer-1缓解PM2.5诱导的促铁死亡信号和表型转化：Fer-1干预减少Fe²⁺积累，抑制脂质过氧化、ROS和MDA升高，降低CD71并升高GPX4；细胞迁移和增殖能力降低，OPN荧光减弱，MMP9减少而α-SMA增加，表明抑制促铁死亡信号可减轻表型转化。

DRP-1抑制调控PM2.5诱导的促铁死亡信号：Mdivi-1减少Fe²⁺积累，降低脂质过氧化、ROS和MDA，下调CD71并上调GPX4，证实DRP1在线粒体自噬与铁死亡信号之间的关键调控作用。

PINK1敲低保护MOVAS对抗PM2.5诱导的促铁死亡信号并抑制表型转化：PINK1敲低显著减轻PM2.5诱导的Fe²⁺积累，部分减少脂质过氧化物，改善ROS和MDA升高，逆转CD71上调和GPX4下调，降低OPN荧光，减轻细胞迁移和增殖，减少MMP9并恢复α-SMA水平，确证PINK1/Parkin介导的过度线粒体自噬是PM2.5诱导促铁死亡信号的上游驱动通路。

讨论部分，研究人员系统阐述了PM2.5通过DRP1-PINK1/Parkin-促铁死亡信号轴驱动VSMC表型转化的分子机制。首先，PM2.5暴露与加速动脉粥样硬化的流行病学关联已得到广泛认可，既往研究多聚焦于巨噬细胞泡沫细胞形成和内皮功能障碍，而本研究将焦点置于VSMC这一斑块核心细胞成分。线粒体功能完整性对VSMC的分化状态至关重要，收缩功能依赖氧化磷酸化产生的ATP稳态供应，线粒体功能障碍破坏能量供应导致细胞无法维持收缩表型。PM2.5通过上调DRP-1破坏线粒体融合-分裂动态平衡，这一GTP水解酶作为线粒体分裂的核心介导因子，其选择性激活反映了PM2.5加剧血管功能障碍的独特机制。

研究人员进一步指出，DRP-1过度激活严重破坏线粒体动态平衡，触发过度线粒体自噬而非保护性清除。线粒体自噬存在PINK1/Parkin介导的泛素依赖性通路和FUNDC1受体介导的非泛素化通路，PM2.5暴露仅特异性激活前者，这与线粒体膜电位下降和mtROS增加密切相关。Mdivi-1处理证实DRP-1抑制可有效减弱PM2.5诱导的线粒体自噬并恢复VSMC表型，表明DRP-1不仅是关联因素更是关键介导者。过度线粒体自噬通过促进线粒体向溶酶体转运、增强溶酶体降解功能，加速游离铁(Fe²⁺)释放并加重细胞内铁超载，从而触发铁死亡级联反应。PINK1敲低实验明确证实PINK1/Parkin介导的过度线粒体自噬是PM2.5诱导VSMC促铁死亡信号的关键上游驱动通路。铁死亡应激参与调控细胞身份和可塑性，Fe²⁺积累诱导高水平ROS产生，作为关键第二信使调控KLF4和SRF等VSMC表型相关转录因子活性，通过转录重编程介导表型转化。

研究结论部分翻译如下：本研究阐明了一条将PM2.5暴露与动脉粥样硬化进展相联系的连贯通路。研究人员证实，PM2.5触发DRP-1依赖性线粒体功能障碍，通过PINK1/Parkin通路导致线粒体自噬受损和生物能量缺陷。该过程诱导促铁死亡信号，最终驱动血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化，促进斑块加速进展。研究数据由此弥合了关键知识缺口，直接将环境损伤与调控线粒体质量控制和血管细胞命运的特定分子通路相联系。