基于流式细胞术的无标记高通量单细胞水平纳米颗粒–细胞相互作用定量分析方法

《Analytical Chemistry》：Label-Free and High-Throughput Quantification of Nanoparticle–Cell Interactions at the Single-Cell Level with Flow Cytometry

　　

在单细胞及单纳米颗粒水平理解纳米颗粒–细胞相互作用对于设计下一代纳米药物至关重要。研究人员探索了将流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)作为一种单细胞技术，用于纳米颗粒–细胞相互作用的无标记定量。研究人员证明了利用常规流式细胞术的侧向散射光(Side Scatter, SSC)信号来定量纳米颗粒与单个细胞之间相互作用的可行性，并通过光学超分辨显微镜对其进行定性印证，通过元素质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)进行定量验证。借助广泛的多参数工作流程，研究人员以＞10,000个单细胞/分钟的分析速度，评估了纳米颗粒尺寸、组成、表面化学和浓度如何影响细胞相互作用，并利用该方法在单细胞水平定量了纳米颗粒摄取动力学。研究人员进一步用超分辨膨胀显微镜(expansion microscopy, ExM)和单颗粒电感耦合等离子体质谱(single-particle inductively coupled plasma mass spectrometry, SP-ICP-MS)验证了结果，并将该工作流程的适用性拓展至混合细胞和共培养体外细胞模型。研究人员所建立的工作流程能够实现纳米颗粒–细胞相互作用的定量理解，从而为理性设计更安全、更有效、更高效的下一代纳米药物提供支持。

该研究主要采用的关键技术方法包括：利用动态光散射(dynamic light scattering, DLS)、紫外–可见分光光度法(ultraviolet–visible spectrophotometry, UV–vis)、透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)、电泳迁移率（Zeta电位）以及单颗粒电感耦合等离子体质谱(single-particle inductively coupled plasma mass spectrometry, SP-ICP-MS)对纳米颗粒进行理化表征；合成并表面修饰不同尺寸（14、40、65、100 nm）的金纳米颗粒(gold nanoparticles, AuNPs)及30 nm银纳米颗粒(silver nanoparticles, AgNPs)，表面化学包括聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)和肝素聚糖(heparosan, HEP)涂层；采用RAW 264.7小鼠巨噬细胞、DC2.4树突状细胞、4T1小鼠乳腺癌细胞等细胞系，设置单培养、混合细胞及共培养（比例1:3）模型；利用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)和基于Magnify的膨胀显微镜(expansion microscopy, ExM)进行无标记光学成像验证；采用配备紫、蓝、红激光的光谱流式细胞仪检测侧向散射光面积(side-scatter area, SSC-A)信号，结合分层设门策略（排除碎片、双联体、死细胞、定义SSC阳性区域Q1）进行分析；通过批量模式和单颗粒模式的电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)提供元素定量验证；使用膜染料DiI和DiD区分混合与共培养中的细胞种群；数据统计分析采用四参数logistic(4PL)回归、单相位结合模型、线性拟合等。

研究结果如下：

建立单细胞水平纳米颗粒–细胞相互作用的无标记检测方法：研究人员用100 nm PEG化金纳米颗粒(gold nanoparticles, AuNPs)处理RAW 264.7小鼠巨噬细胞，共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)观察到细胞内出现光散射信号，批量电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)定量约为每细胞10,000个AuNPs；流式细胞术检测显示侧向散射光面积(side-scatter area, SSC-A)(%)显著升高（定义Q1为SSC-A阳性区域），膨胀显微镜(expansion microscopy, ExM)三维重建证实AuNPs定位于细胞内囊泡区室；研究得出侧向散射光(SSC)偏移源于纳米颗粒内在强光散射而非细胞活化或毒性，建立了基于SSC-A的无标记定量框架。

纳米颗粒–细胞相互作用的浓度依赖性无标记定量：研究人员用不同摩尔浓度（最高1.0 nM）的100 nm AuNPs处理RAW 264.7细胞，SSC-A(%)呈浓度依赖的非线性饱和关系，四参数logistic(4PL)模型拟合优度R²=0.9004，半饱和约0.08667 nM，平台在0.2–1 nM间；CLSM图像定量归一化强度与流式SSC-A均呈强线性趋势（R²分别为0.9993和0.9926），证明SSC-A可无标记反映浓度依赖的纳米颗粒–细胞相互作用。

不同纳米颗粒尺寸、组成、表面化学及细胞类型下的无标记定量：研究人员测试14、40、65 nm AuNPs在RAW 264.7细胞中的SSC-A响应，40和65 nm引发显著SSC-A(%)升高（p<0.0001），14 nm因瑞利散射尺度d⁶下散射截面过小而低于检测限；30 nm银纳米颗粒(silver nanoparticles, AgNPs)（PEG化）可被检测且SSC响应强于同尺寸AuNPs；4T1小鼠乳腺癌细胞对100 nm AuNPs也显示显著SSC-A上升；表面化学比较发现肝素聚糖(heparosan, HEP)涂层AuNPs的SSC-A(%)约为PEG化组的21倍，无PEG及2-kDa PEG与10-kDa PEG组间摄取也有差异，表明该方法能敏感反映尺寸、组成、表面化学、细胞类型的影响。

纳米颗粒–细胞相互作用动力学的无标记定量：研究人员在10–100 pM四个浓度下对RAW 264.7细胞做最长24 h时间曲线，高浓度（100 pM、40 pM）SSC-A(%)符合单相结合模型（R²=0.89–0.91），具饱和平台，时间常数τ分别为9.3 h和19.9 h；低浓度（20 pM、10 pM）呈线性增长（R²=0.92和0.83），无平台，反映未饱和缓慢摄取；批量ICP-MS印证时间依赖性增加，证明该方法可无标记定量摄取动力学。

RAW 264.7与DC2.4混合细胞群中的纳米颗粒–细胞相互作用无标记定量：研究人员用膜染料DiI（RAW）和DiD（DC2.4）区分细胞，在1:1、5:1、1:5混合比例下流式检测显示DC2.4细胞SSC-A(%)显著高于RAW 264.7（p<0.0001），且各比例下各自SSC-A(%)稳定；CLSM显示DC2.4内纳米颗粒分布更均匀，RAW 264.7呈异质性（ elongated细胞摄取更高），表明方法能在混合种群中无标记分辨不同细胞类型与纳米颗粒相互作用差异。

RAW 264.7与DC2.4共培养模型中的纳米颗粒–细胞相互作用无标记定量：研究人员按增殖校正后1:3比例共培养，用0.1 nM 100 nm AuNPs处理，结果显示共培养中RAW 264.7的SSC-A(%)显著高于单培养（p<0.0001），DC2.4的SSC-A(%)无显著变化；推测DC2.4分泌细胞因子可能活化巨噬细胞促进摄取；光谱流式克服了DiI/DiD荧光渗漏问题，通过设门排除双阳性事件；表明无标记SSC结合最少荧光标记可分析共培养中细胞类型特异的纳米生物相互作用。

讨论部分总结：研究人员指出，既往侧向散射光(SSC)相关研究多集中于定性检测纳米颗粒存在、基因毒筛查或特定纳米颗粒–细胞系组合下SSC与ICP-MS校准定量；本研究将其拓展为更广泛的多参数工作流程，系统关联纳米颗粒理化参数（尺寸、表面化学、组成、浓度）与摄取动力学及细胞行为，并延伸至混合细胞、共培养等生理相关体外模型。无标记指利用固有光散射检测纳米颗粒–细胞相互作用，细胞种群鉴别可视需最少量免疫表型、遗传报告或固有散射/形态区分，复杂异质样本可能仍需有限标记。该方法对强光散射无机纳米材料（金属及复合）有效，对小尺寸（如14 nm AuNPs）或弱散射材料（聚合物、脂质体）敏感性有限；未来工作将拓展材料种类、整合多参数流式、应用于原代细胞及体内来源组织。该高通量工作流程能无标记、保留表面化学、非破坏性、快速分析大细胞种群，为纳米药物递送理性设计、安全性与转化性能提供实用筛选平台。

结论部分原文翻译：在本研究中，研究人员确立了常规流式细胞术可作为无标记、高通量策略在单细胞分辨率下定量纳米颗粒–细胞相互作用。研究人员证明侧向散射信号能敏感反映纳米颗粒尺寸、组成、表面化学、浓度和摄取动力学的差异，并通过高分辨光学成像和元素质谱验证了这些测量。与依赖荧光标记、破坏性制备步骤或低通量显微镜的现有方法不同，该工作流程保留了纳米颗粒表面化学，能快速分析大细胞种群，并将无标记检测拓展至混合细胞和共培养模型。基于先前将SSC用于单细胞类型系统中无标记检测纳米颗粒摄取、基因毒筛查或特定纳米颗粒–细胞系组合定量校准的研究，本工作将其发展为更广泛的多参数工作流程，将特定纳米颗粒理化参数与内化动力学及混合细胞、共培养环境中的细胞行为联系起来。虽然该方法对具强光散射性质的纳米颗粒最有效，对小纳米颗粒敏感性可能降低，但未来工作将聚焦于拓展检测到更多材料、整合多参数流式，并将框架应用于原代细胞和体内来源组织。通过对多样纳米颗粒设计和生物背景下纳米生物相互作用的系统单细胞筛选，该工作流程为理性工程化纳米颗粒以改善纳米药物递送、安全性和转化表现提供了实用且可扩展的途径。