柑橘属植物（Citrus maxima）纳米乳液的生物活性、生化效果及分子对接评估：作为可持续性生物杀虫剂用于防治稻纵卷叶虫（Sitophilus oryzae）

《Journal of Stored Products Research》：Bioactivity, biochemical efficacy and molecular docking evaluation of Citrus maxima nanoemulsions as sustainable bioinsecticides against Sitophilus oryzae

　　

A.G.W.U. Perera | W.M.C.T. Wickramasinghe | J.M.M.B.T. Premarathna | W.H.K.E. Senevirathne | W.D.T.A. Sandeepanie | I.D.C.W.I. Devindi | U.A.A. Rodrigo | R.S. Diyabalanage | R.S. Jayakody

斯里贾亚瓦迪内普拉大学应用科学学院动物学系，斯里兰卡

摘要

植物提取的精油是很有前景的生物杀虫剂，但其实际应用受到快速降解的阻碍。纳米乳液可以提高精油的稳定性，并在较低浓度下提高其生物利用度。因此，本研究制备了基于Citrus maxima精油的纳米乳液（CMNEs），并对其毒性、驱虫效果、乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制作用以及对S. oryzae的生化效应进行了评估。通过in silico分析阐明了S. oryzae AChE（UniProt ID: A0A6J2XC02）抑制的分子机制。Citrus maxima精油中d-柠檬烯的含量为85.4%。CMNEs（1:4和1:5 v/v CMEO:Tween80）的平均粒径分别为13.07纳米和9.4纳米，PDI值较低（0.26 – 0.21），ζ电位为-14.52至-16.32毫伏。CMNE（1:4）和CMNE（1:5）的毒性约为CMEO的3倍，LC₅₀值分别为1.06微升/克和0.7微升/克。驱虫效果显著增强，CMNE（1:4）和CMNE（1:5）的RC₅₀值分别为0.16微升/平方厘米和0.09微升/平方厘米，优于CMEO（RC₅₀ = 0.77微升/平方厘米）。在LC₉₀浓度下，纳米乳液抑制了超过90%的AChE活性（IC_{50[CMNE (1:4)]} = 19.28微摩尔/分钟/毫克；IC_{50[CMNE (1:5)]} = 11.65微摩尔/分钟/毫克），而CMEO仅抑制了43%。纳米乳液还削弱了抗氧化防御机制，表现为CAT和POD活性降低以及GSH/GSSG比率下降。分子对接显示，精油成分与S. oryzaeAChE的结合能较低（-4.5至-6.0千卡/摩尔），其中nootkatone的结合能最低。分子动力学模拟表明，nootkatone能够稳定占据S. oryzaeAChE的结合位点，并在整个模拟过程中保持与ACh相似的相互作用模式。本研究首次报道了通过纳米乳化技术提高Citrus maxima精油生物效力的方法，使其成为纳米级AChE靶向生物杀虫剂的天然来源。

引言

收获后储粮过程中，粮食及其加工产品因害虫侵害而造成的损失具有重大的经济意义，这一直是维护全球粮食安全的核心问题。在这些害虫中，Sitophilus oryzae是破坏储粮数量和质量的普遍存在者。几十年来，控制S. oryzae侵扰主要依赖合成杀虫剂。然而，这些杀虫剂的不合理使用一直存在问题，因此人们越来越愿意探索替代的生物防治方法。

由于植物来源，精油（EOs）因其可生物降解性、抗害虫能力和经济合理性而受到青睐（Chang等人，2017年；Sugumar等人，2014年）。Citrus maxima（L.）Osbeck是一种富含EO的柑橘类水果，其生物活性已在蚊子（Mahanta等人，2017年；Misni等人，2019年）、蚂蚁（Khanikor等人，2021年）、白蚁（Pandey和Upadhyay，2023年）以及储粮害虫（Visakh等人，2022年；Zia等人，2013年）上得到研究。

然而，EOs是化学和结构上不稳定的挥发性化合物，水溶性差，易受非生物因素影响而发生转化和降解（Chenni等人，2020年），这影响了它们的生物效力和持久性。由于这些缺点，EOs在实际应用中难以有效用于储粮害虫管理。

尽管如此，通过将其封装在纳米乳液（NEs）中可以克服上述缺点。NEs是动力学稳定的胶体系统，形成1至100纳米大小的纳米滴液，分散在水相中（Kavallieratos等人，2021年；Mushtaq等人，2023年）。NEs中的微小颗粒尺寸可以保护封装的EO成分免受降解，通过延长动力学平衡来调节其持续释放，增强水分扩散，并通过减缓化学反应性提高分子稳定性（Chenni等人，2020年；Firoozi等人，2020年；Lucia和Guzmán，2021年）。在纳米制剂参数中，滴液大小对低剂量下的NE生物活性至关重要。随着纳米级油滴尺寸的减小，表面积与体积比显著增加，使得封装的EO成分与昆虫体内的目标位点的相互作用比传统乳液中的大颗粒物质更有效（Tripathi等人，2021年；Kavallieratos等人，2021年）。

尽管EOs具有巨大的生物潜力，但其在分子水平上的确切作用机制仍是一个活跃的研究领域。EO成分的关键神经毒性机制之一是抑制乙酰胆碱酯酶（AChE），导致乙酰胆碱积累，从而引起神经元长时间兴奋、麻痹和昆虫死亡（da Silva Barbosa等人，2020年）。AChE抑制剂还可以通过促进活性氧/氮物种的过度生成来引发昆虫的氧化应激，破坏其抗氧化防御系统（Bayrak等人，2017年；G?cer等人，2015年；Gulcin等人，2019年）。具有较小滴液大小的NEs通过更好地穿透昆虫角质层和更有针对性地将生物活性化合物输送到神经组织，增强了这种双重作用。计算毒理学的最新进展使得利用分子对接计算来识别能够结合并抑制昆虫AChE靶点的EO成分成为可能，从而为in vivo生化研究提供依据，进而开发出新型AChE靶向生物杀虫剂（?i; ?ek等人，2024年）。先前的in silico研究已成功使用类似的对接和动力学方法从合成和天然来源中鉴定出潜在的AChE抑制剂（Cetin等人，2025年；Demir等人，2025年；Türkan等人，2025年）。

据文献报道，目前尚未有关于将Citrus maxima精油纳米乳化作为储粮保护生物杀虫剂的报道及其作用机制的研究。在此背景下，本研究制备了基于C. maxima精油的纳米乳液（CMNEs），对其理化性质进行了表征，并评估了其对S. oryzae的生物效力。此外，还确定了CMNEs在in vivo抑制AChE活性以及一些抗氧化防御系统（过氧化氢酶：CAT；过氧化物酶：POD；还原型谷胱甘肽：GSH；氧化型谷胱甘肽：GSSG）方面的毒性作用。为了确定负责观察到的AChE抑制的CMEO成分，进行了针对S. oryzae AChE（UniProt ID: A0A6J2XC02）的in silico分子对接和分子动力学模拟，这可能为开发纳米级AChE靶向生物杀虫剂提供线索。

章节片段

测试昆虫

实验使用在斯里贾亚瓦迪内普拉大学动物学系昆虫室培养多代的S. oryzae实验室种群，在清洁、未受污染的稻粒上进行，实验条件为受控的温度和湿度（25±5°C，75±5%相对湿度，12小时光照：12小时黑暗周期）。起始菌株来自斯里兰卡Batalagoda的稻米研究与发展研究所的育种库存。所有生物测定均

Citrus maxima精油的化学组成

C. maxima果皮精油的产量为0.48%（体积百分比），具有强烈气味。通过GC-MS分析了CMEO的化学组成，结果见表1，总离子色谱图见补充图1。在CMEO中鉴定出9种成分，占总可鉴定成分的92.4%。CMEO成分的化学结构见图1。其中d-柠檬烯（85.4%）是主要成分

讨论

C. maxima果皮精油的化学成分以d-柠檬烯（85.4%）为主，其次是2,5-二甲基己烷-2,5-二氢过氧化物（2.35%）和β-蒎烯（1.38%）。本研究中观察到的CMEO整体化学组成与罗马尼亚、泰国、中国和日本的先前研究结果一致（Chaiyana等人，2014年；Saviuc等人，2010年；Sawamura等人，1991年；Tao和Liu，2012年）。然而，化学类型

结论

纳米乳化显著提高了C. maxima精油对S. oryzae的生物效力，即使在较低浓度下也是如此。CMNE（1:4）和CMNE（1:5）的杀虫活性显著增强，LC₅₀值分别为1.06微升/克和0.7微升/克，而CMEO的LC₅₀为2.74微升/克。纳米乳液在最高浓度下的驱虫效果超过92%，CMNE（1:4）和CMNE（1:5）的RC₅₀值分别为0.16微升/平方厘米和0.09微升/平方厘米，而CMEO仅达到51%

资助

本工作得到了大学研究基金（RC/URG/SCI/2024/36）的支持。

CRediT作者贡献声明

A.G.W.U. Perera：概念构思、研究设计、方法学、项目管理、资源调配、监督、验证、数据可视化、初稿撰写、审稿与编辑。W.M.C.T. Wickramasinghe：数据整理、正式分析、研究实施、验证、数据可视化。J.M.M.B.T. Premarathna：数据整理、正式分析。W.H.K.E. Senevirathne：数据整理、正式分析。W.D.T.A. Sandeepanie：数据整理、正式分析。I.D.C.W.I. Devindi：数据整理、正式分析

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢斯里贾亚瓦迪内普拉大学应用科学学院的仪器中心。