竞争性抑制是Cr(III)对土壤芳基硫酸酶毒性的根本原因：老化过程中的动力学变化及解毒机制的分子验证

《Environmental Pollution》：Competitive Inhibition Underlies Cr(III) Toxicity to Soil Arylsulfatase: Kinetic Transitions During Aging and Molecular Validation of Detoxification Mechanisms

　　

严秋婷|徐万里|穆荣宇|Mallavarapu Megharaj|田海霞|何文祥

中国西北农林科技大学自然资源与环境学院，农业部西北地区植物营养与农业环境重点实验室，陕西省杨陵市712100

摘要

土壤芳基硫酸酯酶（ARS）通过催化有机硫酸盐的水解在硫循环中起着关键作用，并可作为重金属（包括铬（Cr(III)）毒性的敏感生物指标。然而，其对Cr(III)胁迫的响应仍很大程度上未被探索。本研究结合了生态毒理学和分子生物学方法，探讨了五种土壤类型中土壤性质、近期/陈年Cr(III)污染与ARS动力学之间的相互作用。结果表明，土壤有机质和总氮含量影响酶的分布：红土、水稻土和盐土中酶主要存在于细胞外，而黑土和冲积土中则主要存在于细胞内。近期暴露于Cr(III)会导致竞争性抑制（活性损失≤70%；K_ic=0.20-2.32 mM），降低底物亲和力，其中总氮和细胞外组分受影响最严重。细胞内ARS成为最敏感的动力学生物标志物，其生态剂量值（ED₁₀，p <0.05）显著较低，且抑制变异性比其他组分高37倍。随着时间推移（0-90天），黑土中的ARS抑制类型从竞争性转变为非竞争性，而冲积土则表现出混合类型的抑制。竞争性抑制的优势（K_m > K_ic > K_{iu）表明形成了稳定的酶-抑制剂复合物。分子对接证实Cr(III)结合在催化位点（-1.862 kcal mol^-1），FTIR光谱显示N-H蓝移（3170→3380 cm^-1），表明其与N-H基团发生了配位。腐殖酸通过空间位阻作用降低了Cr(III)的毒性（-6.800 kcal mol^-1），使Cr(III)的结合亲和力降低了24%（-2.312 kcal mol^-1）。这些发现揭示了Cr(III)抑制机制及有机质介导的缓解作用，有助于更精确地进行生态风险评估。}

引言

铬（Cr）污染对全球生态可持续性构成了重大威胁。工业活动，尤其是废水排放，每年向陆地环境释放约896吨铬（Mohan和Pittman Jr. 2006）。据报道，三价铬（Cr(III)）污染会严重损害作物生产力，影响种子萌发、形态发育和生理代谢（Azmat等人，2010）。在土壤中，铬主要以Cr(III)形式存在。然而，Cr(III)本身的生态毒性仍知之甚少，因为大多数研究主要关注其在氧化条件下转化为六价铬（Cr(VI)的过程（Gorny等人，2016）。这一知识空白凸显了直接研究Cr(III)对土壤生化过程毒理效应的必要性。

土壤酶在维持土壤健康、肥力和生态系统功能方面起着关键作用。由于它们对污染物敏感，因此可作为环境毒性的可靠生物指标（Lessard等人，2013）。多项田间和实验室研究表明，重金属污染会导致酶活性呈指数级或逻辑斯蒂下降（Wahsha等人，2017）。虽然常用生态剂量（ED_x，即导致酶活性降低x%的污染物浓度）来量化毒性，但ED_x值受底物类型、浓度和剂量-反应模型的影响很大（Sun等人，2022）。相比之下，酶动力学参数（如最大反应速率（V_max）和米氏常数（K_m）提供了更直接和机制性的见解（Loeppmann等人，2016）。这些参数独立于底物浓度，可用于计算抑制常数（K_i），从而表征酶-抑制剂之间的相互作用（Ma等人，2022）。

重金属通过多种机制抑制酶功能，包括竞争活性位点、使蛋白质变性或与酶-底物复合物形成共价键（Loeppmann等人，2016）。抑制类型（竞争性或非竞争性）取决于金属形态、养分可用性和酶的构象状态（Huang等人，2023）。例如，纯溶液中的脲酶对Cr(III)更敏感，在相同浓度下其抑制作用更强（Samborska等人，2004）。细胞外水解酶的动力学行为（如K_m的变化）与土壤性质（如pH值、有机碳含量和C/N比）密切相关（Tejada等人，2011）。由于pH引起的构象变化，K_m增加，导致酶-底物亲和力降低（Tischer等人，2019）。金属抑制机制也受土壤类型影响；例如，Sb(V)在壤土中表现为非竞争性抑制剂，但在沙土中表现为竞争性抑制剂，这种效应受总磷和pH变化的影响（Ma等人，2022）。这些发现强调了土壤基质（矿物质、腐殖质、有机-矿物复合物）在决定酶亲和力和金属抑制动力学中的关键作用（Tejada等人，2008）。然而，土壤性质与铬（尤其是研究较少的三价形式Cr(III)）抑制动力学之间的具体相互作用仍是一个重要的知识空白。

ARS通过催化有机硫酸盐的水解在硫循环中起重要作用，是已知的重金属胁迫生物指标。然而，其对Cr(III)的敏感性和相关动力学行为需要进一步研究。以往的评估主要使用单一土壤类型，尽管中国的土壤类型多样性要求进行多土壤评估，尤其是在受Cr(III)影响的农业区域。为填补这些关键知识空白，本研究采用多土壤方法结合分子对接和FTIR光谱技术，从机制上阐明Cr(III)-ARS相互作用及其对土壤性质和陈年的依赖性。具体目标包括：（1）确定外源Cr(Ⅲ)对不同土壤中ARS活性（总活性、细胞外活性和细胞内活性）的影响；建立剂量-反应关系；计算生态阈值（ED_x）；识别影响Cr(Ⅲ)毒性的关键土壤因素；筛选最敏感的ARS组分用于生物指示；（2）利用酶动力学（V_max、K_m、K_{i）和分子对接模拟及FTIR光谱研究Cr(Ⅲ)对ARS的抑制机制；（3）研究Cr(Ⅲ)陈年对代表性土壤（吉林黑土B2和甘肃灌溉淤积土I5）中ARS活性和微生物生物量碳（MBC）的影响，并分析陈年污染引起的动力学变化。}

章节摘录

土壤选择与表征

选择了五种土壤，以代表对Cr(III)毒性至关重要的物理化学性质，包括pH值（6.01-8.37）、有机质（SOM）（11.7-47.7 g kg^-1）、阳离子交换容量（CEC）（8.70-31.1 cmol kg^-1

土壤类型决定芳基硫酸酯酶的分布和活性

不同土壤类型中ARS在细胞外和细胞内池中的分布存在显著差异（p < 0.01）。红土（R1；80.25%）和沿海盐土（C4；67.73%）中细胞外酶占主导地位，而在水稻土（P3；50.53%）中约占ARS总活性的50%。相比之下，黑土（B2；69.44%）和灌溉淤积土（I5；67.93%）中细胞内酶占主导（图1A）。值得注意的是，水稻土中的ARS总量最高

近期Cr(III)毒性中的竞争性抑制：细胞内敏感性层次及土壤性质的双重调节作用

本研究揭示了ARS活性在细胞内和细胞外组分之间的显著土壤类型依赖性分布。红土（R1）、水稻土（P3）和沿海盐土（C4）中细胞外酶占主导（50.53-80.25%），而黑土（B2）和灌溉淤积土（I5）中细胞内酶占主导（>67.93%）（图1A）。这种差异与有机质和总氮含量密切相关（R² > 0.959，p < 0.01；图1B）。高有机质和总氮含量可能

结论

本研究探讨了土壤性质、近期和陈年Cr(III)污染与ARS活性之间的复杂相互作用。结果表明，土壤类型是决定酶分布的关键因素，有机质和总氮含量可增强ARS活性并缓冲Cr(III)的毒性。细胞内ARS成为最敏感的生态毒理学指标，其生态剂量值（ED₁₀）显著较低（p < 0.05），抑制变异性比其他组分高37倍

CRediT作者贡献声明

何文祥：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。田海霞：撰写 – 审稿与编辑，监督。Mallavarapu Megharaj：撰写 – 审稿与编辑。穆荣宇：数据整理。徐万里：验证。严秋婷：撰写 – 初稿撰写，研究设计，概念构思

Ciarkowska, 2015; Frankenber和Johanson, 1986; Mohan和Pittman Jr, 2006; Sauvé等人，2000; Xie, 2013; El-Sayed M等人，2021.

数据可用性

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利益冲突声明

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