邻苯二甲酸二异戊酯(DiPP)慢性暴露损害成年雌性斑马鱼(Danio rerio)的行为、代谢及生殖过程

《Environmental Pollution》：Chronic exposure to diisopentyl phthalate impairs behavior, metabolism, and reproductive processes in adult female zebrafish (Danio rerio)

　　

摘要：邻苯二甲酸二异戊酯(DiPP, diisopentyl phthalate)作为塑料及消费品中广泛使用的增塑剂，因具有潜在内分泌干扰效应且在包括孕妇在内的国人生物样本中可被检出而备受关注，但环境相关浓度下DiPP对成年脊椎动物的慢性多系统毒性尚缺乏系统表征。为此，研究人员将成年雌性斑马鱼(Danio rerio)慢性暴露于环境相关浓度的DiPP（实测值21.3、40.3和80.5 μg/L，对应标称31.25、62.5和125 μg/L，暴露30天），重点评估其对生殖、代谢及神经行为的影响；水相中DiPP浓度经气相色谱-质谱(GC-MS)进行 analytical confirmation。分子标志物检测仅在最高暴露浓度(125 μg/L标称，实测80.5 μg/L)下进行。氧化应激表现为抗氧化基因失调（脑组织中nfe2l2a、nfe2l2b、sod2和cat上调；肝脏中下调）。成熟卵泡比例升高，雌激素信号基因失调（脑中esr1、esr2a和esr2b下调；卵巢中cyp19a1a上调），并伴有卵巢形态学改变。代谢分析显示脂质和葡萄糖稳态改变，同时肝脏凋亡标志物及解毒通路基因上调。DiPP还引起焦虑样行为及社交互动减少，但不伴运动功能损伤。综上，本研究表明环境相关浓度DiPP可对雌性斑马鱼造成累及生殖、代谢及神经行为过程的多种系统毒性，提示DiPP对水生种群具潜在生态风险，并为将其作为增塑剂使用时纳入监管考量提供依据。

论文解读：邻苯二甲酸二异戊酯(DiPP)慢性暴露损害成年雌性斑马鱼(Danio rerio)的行为、代谢及生殖过程

研究背景与意义

邻苯二甲酸酯类(phthalates)是消费产品和工业应用中普遍使用的增塑剂(plasticizer)，因其易从塑料中浸出而广泛存在于生态系统中。与邻苯二甲酸二丁酯(DBP, dibutyl phthalate)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP, di(2-ethylhexyl) phthalate)等结构类似物常在地表水中被检出(0.1–50 μg/L)不同，邻苯二甲酸二异戊酯(DiPP, diisopentyl phthalate)虽在饮料等介质中被检出达170 μg/L，其在地表水中的报道较少，且人群生物样本（含孕妇尿液）中可检出DiPP代谢物。已有DiPP毒性研究多集中于哺乳动物早期发育阶段或鱼类幼体，关于DiPP对具生殖活性的成年脊椎动物——尤其是成年雌性鱼类——慢性多系统毒性的直接证据几近空白。成年雌性经历滤泡发生(folliculogenesis)、卵黄蛋白原合成(vitellogenesis, VTG合成)及产卵等周期性生理过程，对长期内分泌干扰高度敏感；而慢性低剂量暴露更贴近真实环境污染场景，并能揭示生殖-代谢-神经行为跨系统级联效应。基于此，研究人员假设DiPP可通过干扰核受体通路〔雌激素受体(ER, estrogen receptor, 即esr1/esr2a/esr2b)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα/γ, peroxisome proliferator-activated receptor α/γ)〕及诱导氧化应激，造成雌性斑马鱼多系统损伤，并开展本研究以验证。本文发表于Environmental Pollution。

主要关键技术方法

研究人员使用4月龄成年雌性AB系斑马鱼(Danio rerio)，随机分为阴性对照(超纯水)、溶剂对照(0.001%甲醇)及三个DiPP暴露组(标称31.25、62.5、125 μg/L，实测分别为21.3、40.3、80.5 μg/L)，采用静态换水法每日90%换水维持浓度稳定，持续暴露30天(n=21鱼/组，3个生物学重复)。水相DiPP浓度经气相色谱-质谱(GC-MS, gas chromatography-mass spectrometry)内标法定量确认。分子检测(实时荧光定量PCR即RT-qPCR及蛋白质免疫印迹Western blot)均仅在最高浓度(125 μg/L标称，实测80.5 μg/L)组与对照组间进行，靶基因涵盖抗氧化、凋亡、生殖(雌激素信号、芳香化酶cyp19a1a/cyp19a1b、kiss1)、代谢(PPAR通路及糖异生前体g6pc1a.1/g6pc1b)、神经递质(多巴胺及5-羟色胺系统)相关基因，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参。肝脏卵黄蛋白原(VTG, vitellogenin)经酶联免疫吸附试验(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)定量。卵巢组织经苏木精-伊红(H&E, hematoxylin and eosin)染色行卵泡分期(第1–4期)组织学分析并计算性腺指数(GSI, gonadosomatic index = 卵巢重/体重×100%)。行为学测试含新奇水槽潜水试验(novel tank diving test)评估焦虑样行为、群游(shoaling)试验测群聚离散度及社群偏好(social preference)试验测社交倾向，录像由盲法观察者分析。数据经Shapiro-Wilk及Bartlett检验后选用单/双因素方差分析(ANOVA, analysis of variance)或Kruskal-Wallis非参检验，Tukey事后比较，p≤0.05为差异显著。

研究结果

3.1. DiPP concentration in the tank water（水相中DiPP浓度）

实测浓度分别为标称组的约64–68%(21.3、40.3、80.5 μg/L)，第1、15、30天变异系数<10%，证实30天慢性暴露期间DiPP浓度稳定，后续结果均以实测浓度表述。

3.2. Reproductive impact（生殖影响）

溶剂对照与阴性对照无差异(p>0.05)。125 μg/L标称(80.5 μg/L实测)DiPP暴露下，脑组织中kiss1和vtg1 mRNA分别上调约3倍和4倍，esr1、esr2a、esr2b下调约50%；肝脏vtg1 mRNA上调约3倍，蛋白水平(ELISA)在40.3和80.5 μg/L组显著升高(~400 ng/mL vs 对照<100 ng/mL)；脑Kiss1蛋白较对照上调约3倍。卵巢cyp19a1a(芳香化酶cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1a，负责雌二醇合成)上调2倍。GSI在40.3和80.5 μg/L组升高，组织学示第4期(成熟)卵泡面积占比及数目在各DiPP组(21.3–80.5 μg/L)显著增加(达80–90%)，对照以早中期卵泡为主。结论：DiPP引发生殖内分泌扰动——脑雌激素受体下调伴VTG合成增加及成熟卵泡比例异常升高，提示类雌激素效应及潜在排卵障碍。

3.3. Hepatic and steroidogenic gene expression profiles（肝脏与类固醇生成基因表达谱）

80.5 μg/L组肝脏tp53上调~3.5倍，抗凋亡bcl2a与促凋亡baxa均下调0.5倍，效应凋亡基因casp3a下调1.5倍；脑cyp19a1b(芳香化酶cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1b，脑型芳香化酶)下调50%，卵巢cyp19a1a上调2倍；肝脏解毒基因cyp1a下调80%、cyp3a65下调0.75倍；Western blot示Cyp19a1b蛋白上调约3倍。结论：DiPP诱导肝脏凋亡相关基因重编程及外源物代谢酶抑制，伴随脑与卵巢芳香化酶表达组织特异性反向调控。

3.4. Metabolic dysregulation（代谢失调）

80.5 μg/L组肠组织pparg下调~30%、pparαb下调~50%，糖异生前体g6pc1a.1与g6pc1b下调(后者降0.75倍)；肝脏pparg与pparα均下调~50%，g6pc1a.1与g6pc1b下调约0.75倍；肝Pparα蛋白上调约1.5倍。结论：DiPP致肠道与肝脏PPARα/γ及糖异生关键基因下调，提示脂糖稳态紊乱及肝糖异生抑制，符合类雌激素状态下资源向卵黄合成重定向的代谢偏移。

3.5. Behavioral alterations（行为改变）

各DiPP组(21.3–80.5 μg/L)斑马鱼在新奇水槽中上层停留时间显著缩短、底层停留时间延长，呈焦虑样表现；80.5 μg/L组总游泳距离与平均速度增加( hyperactivity， hyperactivity at highest concentration)，低浓度组运动参数无变化。群游试验中62.5与80.5 μg/L组个体间越界次数(excursion events)增多但平均群间距不变；社群偏好试验中62.5与80.5 μg/L组靠近同种鱼区域(zone 1)停留时间降至<50 s(对照>150 s)，非社交区(zone 4)时间增加，总运动距离与速度无受损。结论：DiPP致焦虑样行为及社交回避(social withdrawal)，但不伴基础运动功能障碍，群聚凝聚力保留而个体交互模式异常。

3.6. Changes in brain neurotransmitter-related and oxidative stress-related gene expression（脑神经递质及氧化应激相关基因变化）

80.5 μg/L组脑组织多巴胺(DA, dopamine)系统基因drd2b、drd4及酪氨酸羟化酶(th, tyrosine hydroxylase)上调，drd2l、drd3及单胺氧化酶(mao, monoamine oxidase)下调；5-羟色胺(5-HT, serotonin)系统基因slc6a4a(SERT)、htr1aa、htr1d、htr2aa、htr2b、htr2cl1上调，htr1ab无变化。脑抗氧化基因nfe2l2a、nfe2l2b、sod2、cat上调1.5–2.75倍，gpx1a下调0.75倍；肝脏所有抗氧化基因(nfe2l2a、nfe2l2b、sod2、cat、gpx1a)显著下调(0.10–0.75倍)。结论：脑启动Nrf2介导抗氧化补偿反应，肝抗氧化防御被抑制；多巴胺与5-羟色胺系统基因协同失调，为行为表型提供分子关联依据。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出：①DiPP对cyp3a65(PXR靶基因)及cyp1a(AhR通路)的下调不同于DEHP等邻苯二甲酸酯的诱导效应，提示DiPP具独特毒理机制；②脑与肝抗氧化基因反向调控反映组织特异性Nrf2通路响应差异——脑高代谢率启动补偿性防御，肝因更高DiPP蓄积致ROS超载压制Nrf2信号，引发肝细胞毒性(tp53及凋亡相关基因改变)；③生殖扰动符合经典慢性雌激素过刺激负反馈——脑esr1/esr2a/esr2b下调但VTG升高、cyp19a1a上调、成熟卵泡堆积，可能源于残余Esr1活性、非基因组雌激素信号或持续雌激素刺激，加速滤泡成熟但未评估是否伴排卵失败；④代谢改变(PPARα/γ及g6pc下调，肝Pparα蛋白上调)体现DiPP结合ER与PPAR双重干扰及能量向卵黄合成重定向的代谢权衡；⑤焦虑样及社交回避与脑多巴胺(TH↑, MAO↓→多巴胺能张力增强，驱动 hyperactivity)及5-羟色胺(SERT↑→突触5-HT降低，受体代偿上调，介导社交退缩)系统失衡相符，且受氧化应激与能量耗竭加剧；⑥野外种群层面，上述行为缺陷可致被捕食风险上升及产卵集群破坏，叠加生殖内分泌失衡，威胁种群续存。局限性含分子检测仅在高浓度开展未做剂量-效应、未测蛋白活性与神经递质浓度、未评估产卵力与子代及雄性/跨代效应。

结论（翻译）

成年雌性斑马鱼慢性暴露于环境相关浓度DiPP可诱发多系统毒性，扰乱生殖功能（加速滤泡成熟、雌激素信号改变）、代谢稳态（脂质/葡萄糖失调）及神经行为（焦虑、社交缺陷）。这些效应与特定分子改变相关联：卵黄蛋白原(VTG)过表达、5-羟色胺/多巴胺系统失衡及氧化应激标志物改变。所试浓度具环境相关性，结合人体生物监测数据，突显DiPP显著健康风险。未来研究应探讨性别特异性及跨代影响，监管部门应将此发现纳入邻苯二甲酸酯风险评估。本结果表明环境相关浓度DiPP即可引致多系统损伤，所观察到的生殖、代谢及行为损害可直接危及个体存活与种群稳定性，提示较高生态风险，上述优先事项将完善生态毒理风险评估并为邻苯二甲酸酯混合物监管策略提供依据。