丛枝菌根真菌通过协同机制调节菌丝体中的细菌群落及相关功能基因，从而在四环素胁迫条件下抑制潜在的氮氧化物（N?O）产生

《Environmental Research》：Synergistic mechanisms by which arbuscular mycorrhizal fungi regulate hyphosphere bacterial communities and functional genes to suppress potential N?O production under tetracycline stress

　　郝世|雷王|吴云书|蔡白燕
中国农业微生物技术工程研究中心，教育部；黑龙江省寒区生态恢复与资源利用重点实验室；黑龙江大学生命科学学院分子生物学重点实验室，哈尔滨，150080，中国

**摘要**
四环素（TC）是一种广泛使用的兽用抗生素，经常在农业土壤中积累，并破坏氮（N）循环，从而增加一氧化二氮（N2O）的排放。然而，基于生物的缓解策略及其潜在机制仍不甚明了。在本研究中，我们进行了一个大豆盆栽实验，设置了四种处理方式：对照组、丛枝菌根真菌（AMF）接种、添加TC以及AMF与TC联合处理。通过结合菌丝体特异性采样、潜在N2O产生率测量、16S rRNA基因测序、定量PCR、宏基因组学和偏最小二乘路径建模，系统地阐明了AMF在TC胁迫下对N2O产生的调节作用。TC显著增加了潜在N2O产生率（+21.2%），主要是通过选择性地抑制末端反硝化步骤实现的，这表现为一氧化二氮还原酶（NOS）活性降低和nosZ基因丰度减少，导致反硝化途径受阻和N2O积累。相比之下，在TC胁迫下接种AMF使潜在N2O产生率降低了29.5%，恢复到对照组水平。从机制上看，AMF改善了菌丝体土壤性质（如增加SOC和TN，并增强了TC的消解），并选择性地富集了具有TC耐受性的功能菌群，特别是含有nosZ的菌类如链霉菌，从而修复了反硝化途径的完整性。路径建模进一步表明，AMF通过增强氮循环微生物的功能能力以及优化土壤物理化学条件，直接和间接地减少了N2O的产生。我们的发现揭示了抗生素增强N2O排放的微生物和分子机制，并强调了AMF作为一种低投入、基于自然的环境生物技术策略，可以同时修复受抗生素污染的土壤并减少农业温室气体排放。

**引言**
四环素（TCs）是广泛用于畜牧业和水产养殖的广谱抗生素（Chen等人，2025；Li等人，2020a）。由于它们在环境中不易降解，TCs最终会在农业土壤中持续存在并积累（Lu等人，2024）。由于其广泛的抗菌活性和环境持久性，TCs现在被认为是一类重要的新兴污染物（Lian等人，2021）。土壤中的残留TCs对本土细菌群落施加了强烈的选择压力，抑制了敏感菌类，从而重塑了微生物群落结构和多样性（Li等人，2024b；Zhang等人，2018）。这种扰动可能会进一步阻碍关键的细菌驱动的生物地球化学过程，特别是氮（N）循环中的关键步骤，对土壤生态功能构成潜在风险（Grenni等人，2018）。
氮循环对于维持土壤肥力和生态系统可持续性至关重要；当其受到破坏时，会加剧一氧化二氮（N2O）的排放（Hayat等人，2025）。作为一种强效的温室气体，N2O的全球变暖潜力大约是CO2的300倍，同时还会导致平流层臭氧层损耗，对全球气候和生态环境构成严重威胁（Bueno-Alejo等人，2025）。农业活动是全球N2O排放的主要人为来源，占总排放量的60%以上（Feng和Li，2023）。在细菌介导的氮转化过程中，硝化作用和反硝化作用是N2O的主要来源。在硝化过程中，amoA基因编码的氨单加氧酶催化NH3氧化为羟胺，而nxrB基因编码的亚硝酸盐氧化还原酶参与NO2?氧化为NO3?。在反硝化过程中，硝酸盐（NO3?）逐步还原为氮气（N2）。这一途径由编码关键酶的功能基因依次调控。具体来说，narG编码硝酸盐还原酶，催化NO3?还原为NO2?；nirK/nirS编码亚硝酸盐还原酶，介导NO2?还原为NO；norB编码一氧化氮还原酶，催化NO转化为N2O；nosZ编码一氧化二氮还原酶，进一步将N2O还原为N2（Xu等人，2024a；Bueno等人，2022）。在这些步骤中，nosZ介导的末端还原决定了N2O是否可以进一步转化为N2，使得nosZ的调节成为控制潜在N2O产生率的关键功能过程（Frostegard等人，2021）。先前的研究表明，抗生素胁迫可以选择性抑制含有nosZ的细菌的生长，从而影响反硝化的完整性并促进N2O在土壤中的积累和排放（Zhang等人，2025）。尽管TC可以显著影响特定农业土壤系统中的N2O排放，但这种效应的方向和程度强烈依赖于土壤性质、施肥制度、暴露浓度和微生物群落组成（Semedo等人，2018；DeVries和Zhang，2016）。这些相互作用因素使得在区域或全球尺度上准确量化TC引起的土壤N2O释放变得困难。这一知识空白突显了阐明TC胁迫下N2O排放模式及其涉及的微生物调节机制的必要性。然而，TC残留物对农业土壤N2O排放及其细菌驱动因素的具体影响仍不甚明了。

丛枝菌根真菌（AMF）是陆地植物的普遍共生体。通过广泛的菌丝网络，AMF显著增强了宿主植物的养分吸收，同时深刻改变了土壤微环境（如pH值、氧气状态和溶解有机碳）（Kakouridis等人，2024；Magkourilou等人，2024）。菌丝体是一个受AMF根外菌丝影响的独特土壤生态位，通常是细菌相互作用的热点（Wang等人，2022）。越来越多的证据表明，AMF可以通过其菌丝“招募”和调节特定的细菌组合，从而影响土壤碳和氮的转化（Xu等人，2018）。例如，在氮过剩（如高硝酸盐或铵盐可用性）和氮限制的情况下，接种AMF已被证明可以增加反硝化细菌的丰度并促进nosZ介导的N2O还原（Zhu等人，2024；Li等人，2023）。此外，AMF在减少温室气体排放方面的作用受到了越来越多的关注，尽管其潜在机制在不同植物-土壤系统中有所不同（Liang等人，2019）。从植物-土壤连续体的角度来看，抗生素残留物也可以被视为影响高等植物生长、发育和根际生态过程的非生物胁迫因素。关于高等植物发育调节和非生物胁迫反应的先前研究表明，在盐度、干旱、重金属等环境胁迫下，植物主要通过调节激素信号（Basit等人，2025）、氧化还原平衡（Basit等人，2024）、渗透调节（Zulfiqar等人，2021）、抗氧化防御系统（Ulhassan等人，2025；Alfadil等人，2021）、光合作用代谢和根系结构可塑性（Gui等人，2020）来维持生长和适应能力。这些植物反应不仅决定了宿主植物本身的耐受性，还可能通过改变根系生长、碳分配和根系分泌物组成来影响根际和菌丝体微生物群落的组装和功能表达。因此，将AMF介导的菌丝体微生物群落调节置于高等植物非生物胁迫反应和发育调节的更广泛背景下，可以更好地理解植物-AMF-细菌相互作用如何影响土壤氮循环和抗生素胁迫下的潜在N2O产生率。

鉴于AMF的缓冲胁迫能力，一个未解决的问题是AMF是否能够抵消抗生素对土壤细菌网络的干扰。具体来说，AMF能否富集既耐TC又含有nosZ的细菌类群，从而在TC胁迫下维持反硝化途径的完整性？解决这个问题不仅有助于我们理解抗生素污染与温室气体排放之间的联系，而且对于联合国可持续发展目标（SDGs）框架下的气候行动和可持续土地利用具有实际意义（Visser等人，2019）。研究表明，AMF可以通过分泌铁结合糖蛋白glomalin来改变根际和菌丝体微环境，从而在菌丝体中创建功能特化的微生物“热点”。在重金属污染和盐度等胁迫条件下，这种靶向富集可以显著增强参与氮循环的功能微生物群落的活性（Duan等人，2024；Faghihinia等人，2022）。此外，新兴研究开始识别同时携带抗生素抗性基因和反硝化基因（如nosZ）的“多功能”细菌类群，并探讨AMF菌丝是否通过提供生态位机会或碳源优势来优先支持它们的定植，从而在抗生素胁迫下维持反硝化途径的完整性（Zhang等人，2022；Feng等人，2020）。微生物共现网络分析进一步表明，引入AMF可以增加网络复杂性和稳定性，通过保护或重建关键功能模块（如N2O还原模块）来缓解抗生素引起的功能损伤（Li等人，2024a；Shi等人，2025）。总体而言，这些进展突显了AMF作为“生态系统工程师”的潜力，能够在共同应对土壤污染和温室气体排放方面发挥核心作用。

因此，我们提出了两个假设：（1）TC胁迫通过抑制具有N2O还原潜力和nosZ相关功能的细菌类群，在反硝化的末端步骤中增加潜在N2O产生率，从而削弱N2O向N2的还原；（2）AMF接种会调节菌丝体细菌群落结构并富集具有N2O还原潜力的耐TC功能菌群，从而部分补偿TC引起的末端N2O还原能力的损失，降低潜在N2O产生率。与以往的研究相比，本工作的新颖性主要体现在两个方面。首先，本研究关注的是直接受AMF根外菌丝影响的菌丝体微域，而不是传统的根际或整体土壤，从而揭示了AMF在TC胁迫下对土壤氮循环的微域尺度调节作用。其次，通过整合多种证据，包括菌丝体细菌群落结构、功能基因、酶活性和潜在N2O产生率，本研究建立了一个假设的机制框架，将AMF介导的菌丝体调节、功能微生物群落重构、nosZ相关N2O还原的恢复以及潜在N2O产生率的抑制联系起来。本研究提供了多层次的证据，证明AMF有助于调节受抗生素污染土壤中的潜在N2O产生，并为开发结合污染土壤修复和温室气体缓解的AMF辅助策略提供了理论基础。

**土壤和宿主植物**
土壤样本取自中国黑龙江省哈尔滨市黑龙江大学寒区生态恢复与资源利用重点实验室实验田的0–25厘米耕作层（126°37′ E, 45°42′ N）。空气干燥后，土壤通过0.5厘米筛网过滤以去除植物残余物和其他杂质。本研究未对实验土壤进行灭菌，以保留本土微生物群落和氮循环功能，从而使AMF定植重塑了菌丝体土壤的生化性质。

**AMF定植和菌丝密度**
图2a和b显示了整个大豆生长期间AMF的定植和菌丝密度。在A和AT处理下，大豆根系中观察到明显的AMF定植，其定植率和菌丝密度均显著高于CK和T处理（p < 0.05）。随着时间的推移，定植逐渐增加；在75天时，A和AT处理的根系定植率均超过70%，菌丝密度分别达到3.1 m g?1和2.6 m g?1。

**TC胁迫对菌丝体土壤中反硝化途径的影响**
我们的结果表明，TC胁迫加剧了菌丝体土壤中的N2O产生，并提供了一整套证据，将细菌群落组成的变化与功能基因谱型的变化联系起来。与其他抗生素（如磺胺类和氟喹诺酮类）的先前发现一致，我们的数据表明，作为广谱抗生素的TC对氮循环细菌施加了强烈的选择压力。这种压力的直接后果是反硝化过程受损。

**结论**
本研究表明，TC胁迫通过改变土壤物理化学性质和细菌群落组成，显著增加了菌丝体土壤中的潜在N2O产生率。具体来说，TC显著抑制了nosZ的拷贝数和NOS活性，同时促进了nirK和norB的拷贝数及其相应酶的活性，从而破坏了反硝化途径的完整性并增加了N2O的积累。AMF接种有效缓解了这一现象。

**作者贡献声明**
郝世：数据整理、正式分析、初稿撰写。
雷王：数据整理、正式分析、可视化。
吴云书：数据整理、调查、验证。
蔡白燕：资金获取、审稿与编辑。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
本研究得到了中国黑龙江省自然科学基金（项目编号LH2023C088）和黑龙江省生态环境保护科学研究项目（项目编号HST2022TR002）的支持。该资助机构并未参与该研究的设计、数据收集、分析或解释工作，也未参与手稿的撰写。