利用抗溶剂沉淀法(antisolvent-based method)制备介尺度乳清蛋白聚集体(mesoscale whey protein aggregates, mWPA)以改善热稳定性与泡沫稳定性

《Food Hydrocolloids》：Improving heat stability and foam stability using mesoscale whey protein aggregates manufactured through an antisolvent-based method

　　

本研究考察了通过可放大的液相抗溶剂(liquid antisolvent, LAS)沉淀—热处理—微射流(microfluidization)联用工艺制得的介尺度乳清蛋白聚集体(mesoscale whey protein aggregates, mWPA)的理化性质、界面性质、起泡性及乳化性，并与未处理乳清蛋白分离物(whey protein isolate, WPI)及常规热诱导乳清蛋白聚集体(conventional whey protein aggregates, cWPA)进行比较。mWPA呈更致密球形形貌，水合粒径约197 nm，区别于具分形形貌(~70 nm)的cWPA及球形小分子WPI。理化表征表明，mWPA较WPI具更高表面疏水性、更高表面电荷，且经90°C加热30 min后胶体稳定性更佳。动态吸附测定显示，低蛋白浓度(0.025–0.25% wt/vol)下mWPA初始吸附动力学与WPI相当，但高浓度(1% wt/vol)下平衡表面压较低，表明mWPA在气—水界面受限的重排与持续吸附。mWPA起泡能力与WPI及cWPA相当，但泡沫稳定性更优，归因于：(1)低浓度(0.025–0.05% wt/vol)下形成更刚性的界面膜(膨胀流变实验具更高弹性模量E′)；(2)高浓度(1% wt/vol)下颗粒在液膜(lamellae)及Plateau边界(Plateau borders, PB)中的物理截留。油—水模型乳液中，mWPA乳化活性指数(emulsifying activity index, EAI)高于WPI，但引发明显液滴絮凝及储存期间液滴聚结与上浮，乳液稳定性降低。本研究成功证明了一种可放大的WPI改性方法，可获得具增强热稳定性与泡沫稳定性的蛋白胶体颗粒。

论文解读：利用抗溶剂沉淀法制备介尺度乳清蛋白聚集体(mWPA)改善热稳定性与泡沫稳定性

研究背景与意义

乳清蛋白分离物(whey protein isolate, WPI)是食品工业中广泛使用的起泡与乳化功能性配料，但其耐热性差，受热易变性聚集，且单独WPI稳定的泡沫在液相排液、气泡聚并和歧化作用下稳定性有限。已有研究表明热诱导或聚集改性能改善部分功能性质，但不同聚集方式（粒径、形貌、表面性质）对泡沫稳定机制的影响尚无定论，且传统Taylor-Couette流动装置制备线性聚集体难以放大。本研究旨在开发一种基于液相抗溶剂(liquid antisolvent, LAS)沉淀结合热处理与微射流(microfluidization)的可放大工艺，制备介尺度乳清蛋白聚集体(mesoscale whey protein aggregates, mWPA)，系统表征其理化、界面、起泡及乳化性质，阐明结构—功能关系(structure-function relationships)，为开发高热稳定性和高泡沫稳定性的WPI基食品配料提供依据。该论文发表于《Food Hydrocolloids》。

主要关键技术方法

研究人员设置三组样本：①未处理WPI（对照）；②常规热诱导聚集体cWPA〔仅80°C加热20 min之hWPA及再经150 MPa六次微射流之hmWPA〕；③实验组mWPA〔WPI分散液注入乙醇:甘油=75:25(v/v)抗溶剂中锚式搅拌沉淀→80°C加热20 min→离心洗去抗溶剂→重分散于10 mM磷酸缓冲液pH 6.8→150 MPa微射流六次〕。采用透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察形貌；动态光散射(dynamic light scattering, DLS)测粒径(hydrodynamic diameter, d_h)与多分散指数(polydispersity index, PDI)；电泳迁移率算ζ电位；ANS荧光探针法测表面疏水性指数(H₀)；90°C加热30 min前后测粒径分布与500 nm吸光度(optical density, OD₅₀₀)评价热稳定性；Native-PAGE及还原/非还原SDS-PAGE分析分子量分布；悬滴法(pendant drop method)测气—水(air-water, A-W)界面动态表面吸附与表面压(π)；振荡滴模块测界面膨胀流变学( dilatational rheology，含频率扫描、振幅扫描及Lissajous曲线)；动态泡沫分析仪(dynamic foam analyzer, DFA)测起泡能力(foam capacity, FC)与泡沫稳定性(以900 s剩余泡沫体积RFV_900s表示)；转子—定子初乳化＋微射流制油—水(oil-in-water, O/W)乳液，激光衍射测粒度分布并计算乳化活性指数(emulsifying activity index, EAI)、絮凝指数(flocculation index, FI)与聚并指数(coalescence index, CI)，加SDS区分絮凝与聚并。所有实验取两个独立批次，显著性水平P＜0.05。

研究结果

3.1 Manufacturing process of mWPA

抗溶剂沉淀及80°C热处理使WPA呈线性结构，经微射流(150 MPa，6次)可将平均粒径由~29 μm降至~0.5 μm，选用此条件进行后续表征，证明该常规搅拌抗溶剂法具备工业放大潜力。

3.2 Morphology and particle size characterization

TEM显示mWPA为致密球形聚集体(~100 nm)伴少量分形结构，cWPA(hWPA/hmWPA)呈开放不规则分形(~50–70 nm)，WPI为单体/二聚体(~4 nm)。DLS示mWPA单峰分布模径~100 nm，d_h≈197 nm，PDI＜0.3；hWPA/hmWPA峰位~50–70 nm；WPI为多峰分布。表明不同工艺导致显著结构差异。

3.3 ζ-potential

mWPA ζ电位?33.27 mV显著高于WPI(?26.23 mV)(P＜0.05)，与cWPA无显著差异，说明聚集后表面负电荷增加，依据DLVO理论有利于胶体静电稳定。

3.4 Surface hydrophobicity

mWPA表面疏水性指数H₀(24.89)显著高于WPI(6.14)但低于hWPA(32.49)与hmWPA(26.51)(P＜0.05)，与紧凑球形聚集体将部分疏水位点包埋于内部相符。

3.5 Heat stability

WPI经90°C 30 min加热后粒径分布峰右移(3→8 nm)，OD₅₀₀显著升高；mWPA粒径分布与OD₅₀₀无明显变化，表明mWPA因已形成的分子间二硫键与疏水相互作用具刚性结构，抗热聚集能力优于原生WPI。

3.6 Molecular mass distribution by gel electrophoresis

Native-PAGE中mWPA存于样品孔的高分子量(high-molecular-weight, HMW)聚集体为主，少量单体条带；非还原SDS-PAGE仍见HMW滞留，还原条件下消失并解离为二聚体/单体，证实mWPA主要靠二硫键(disulfide bonds)稳定，辅以疏水作用；mWPA中出现3.5–10 kDa小分子量肽片段而WPI中未见。

3.7 Dynamic surface adsorption

低浓度(0.025–0.25% wt/vol)mWPA与WPI初期吸附速率(π_2s)及平衡表面压π_14400s相当；1% wt/vol时WPI π_14400s显著更高(~23.95 vs ~21.80 mN·m^?1)，且WPI曲线未达平台暗示持续重排或多层吸附，mWPA因预聚集刚性大较快达平衡，表明mWPA在A-W界面吸附受限。

3.8 Dilatational rheology

频率扫描：低浓度(0.025–0.25% wt/vol)mWPA界面膜弹性模量E′高于WPI，频率依赖性斜率n更低(0.043–0.081 vs 0.139–0.167)，表明形成更刚性、扩散交换受限的黏弹膜；1% wt/vol时WPI E′更高、n更低(0.026)，暗示形成多层/二维网络。振幅扫描与Lissajous曲线示低浓度mWPA具较高E′但应变下呈轻微非线性响应，高浓度WPI界面膜更具拉伸性与弹性。

3.9 Foaming properties

3.9.1 Foam capacity：mWPA与WPI起泡能力相当，均随浓度升至临界值(0.05% wt/vol)而增加后持平；cWPA起泡能力相似但气泡平均半径更大。

3.9.2 Foam stability：各测试浓度(0.025–1% wt/vol)mWPA剩余泡沫体积(RFV_900s)均高于WPI与cWPA(P＜0.05)。低浓度下优越稳定性关联更刚性A-W界面膜(高E′)；高浓度下还归因于连续相中未吸附mWPA颗粒在液膜(lamellae)与Plateau边界(PB)内物理截留，增黏阻排液、抑制气泡歧化与聚并。cWPA中仅经微射流之hmWPA泡沫稳定性接近WPI，hWPA最差。

3.10 Emulsifying properties

3.10.1 Emulsifying activity：mWPA乳化活性指数(EAI)显著高于WPI(P＜0.05)，能形成更小初始油滴。

3.10.2 Emulsion stability：mWPA乳液新制即现明显絮凝(FI~1123% vs WPI~0.1%)，粒度呈双峰，加SDS粒径减小证实为可逆絮凝；储存24 h仍存絮凝并出现聚并与上浮分层(CI升高)，WPI乳液无此现象。推测mWPA较大粒径、高表面疏水性致界面覆盖不足及吸附态颗粒间疏水吸引引起桥连絮凝。

讨论与结论翻译

介尺度乳清蛋白聚集体(mWPA)经可放大的LAS抗溶剂—热处理—微射流工艺制得，较对照WPI及常规热诱导cWPA具独特形貌(致密球形，~197 nm)、更高表面电荷与表面疏水性及更优耐热性。界面膨胀流变显示低浓度(0.025–0.25% wt/vol)下mWPA形成较WPI更刚性A-W界面膜，高浓度(1% wt/vol)下WPI形成更刚性多层膜。mWPA与WPI起泡能力相当，但mWPA泡沫稳定性优于WPI与cWPA——低浓度时靠刚性吸附膜抑制聚并，高浓度时靠体相颗粒在液膜与Plateau边界内截留增黏阻排液。尽管mWPA具更高乳化活性，其稳定O/W乳液发生即时液滴絮凝并在储存中持续絮凝、聚并与上浮。综上，mWPA具作为泡沫稳定功能性配料的潜力，若用于乳化体系需进一步优化蛋白—油比例或复配表活以抑制疏水驱动絮凝。