利用基于重组酶聚合酶扩增的侧向流动条技术和实时荧光检测方法，快速灵敏地检测猪肉中的假结核耶尔森菌

《Food Microbiology》：Rapid and sensitive detection of Yersinia pseudotuberculosis in pork using recombinase polymerase amplification-based lateral flow strip and real-time fluorescence assays

　　张学华|阿什拉夫·尼达|傅桥琴|黄旭轩|徐鹏新|杨晓涵|王申奇
华中科技大学先进生物材料与组织工程中心，武汉430074，中国

**摘要**
重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种在恒定温度下扩增核酸的有前景的技术；其简单的操作流程、最低的设备要求以及快速的检测时间使其非常适合用于食品安全检测。本研究基于RPA技术开发了两种快速且灵敏的检测方法，用于检测食品中的假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）。第一种方法将RPA与侧向流动条（RPA-LFS）结合，以实现可视化读数。该方法对常见的食源性细菌具有高特异性，并能在30-45°C的温度范围内检测到假结核耶尔森菌。高浓度的模板可在10分钟内被检测到，而低浓度则需要20-30分钟。通过probit分析确定的检测限（LOD）为206 CFU/mL（95%概率）。第二种方法将RPA与实时荧光检测（RT-RPA）集成，允许连续监测扩增产物。RT-RPA能够检测到低至47.5拷贝/μL的纯DNA模板以及103 CFU/mL的细菌悬浮液。对于10^6-10^2拷贝/μL的DNA模板，扩增过程需要3-14分钟；对于10^7-10^3 CFU/mL的煮沸细菌悬浮液，扩增过程需要3-10分钟。这两种方法在人工污染的猪肉样本中均显示出100%的准确性，并且结果与qPCR一致。本研究构建的RPA-LFS和RT-RPA检测方法能够快速准确地检测假结核耶尔森菌，这对于食品安全应急情况至关重要。

**引言**
假结核耶尔森菌是一种小型、革兰氏阴性、兼性厌氧细菌，可感染多种宿主，包括家养和野生动物以及鸟类，因此可能是人畜共患食源性病原体的来源（Giannitti等人，2014年）。人类感染主要通过摄入受污染的食物和水发生（Hashimoto等人，2021年）。该细菌通过粪-口途径传播，导致耶尔森菌病（Bonardi等人，2016年；Sundin等人，2020年；Lee等人，2021年），这是2022年欧盟报告的第三大常见食源性胃肠道感染（EFSA和ECDC，2023年）。症状包括发热和急性腹痛，有时会模仿阑尾炎，导致不必要的阑尾切除术（Wielkoszynski等人，2018年；Iwata等人，2020年）。更严重的并发症包括反应性关节炎、结节性红斑、赖特综合征、肾小球肾炎、心肌炎或败血症（Wielkoszynski等人，2018年）。早期和精确地检测这种病原体对于减轻严重后果和减少与假结核耶尔森菌感染相关的社会经济影响至关重要。尽管传统的平板计数方法有效可靠，但其平均耗时5-7天，因此耗时且劳动强度大（Farooq等人，2018年；Asif等人，2021年）。几种基于PCR的方法，包括传统PCR、qPCR和PCR核酸条方法，也被用于检测食品中的假结核耶尔森菌。尽管这些方法准确性高，但PCR需要电泳设备，而实时PCR则需要较长的检测时间，并且依赖于实验仪器，无法满足资源有限地区的现场便捷检测需求（Gao等人，2022年）。最近的研究中，免疫学检测方法和生物传感器研究发挥了重要作用；然而，它们需要熟练的操作人员和专用仪器，这限制了它们的实用性（Panwar等人，2023年）。因此，开发快速且超灵敏的检测方法以满足这些需求至关重要。

在分子诊断领域，重组酶聚合酶扩增（RPA）相比传统PCR和其他恒定温度核酸扩增技术具有显著优势。与需要精确温度循环的PCR不同，RPA在37-42°C的恒定温度下运行，无需复杂设备，使其更适合现场检测和资源匮乏环境下的快速诊断（Lobato和O’Sullivan，2018年；Tan等人，2022年）。此外，RPA的反应时间明显更短，通常在30分钟内即可得出结果，而PCR至少需要90分钟才能完成（Ji等人，2025年）。其极高的灵敏度进一步增强了其实用性，因为它可以检测到低至1-10拷贝的目标DNA（Lobato和O’Sullivan，2018年；Zhao等人，2023年）。除了RPA之外，环介导等温扩增（LAMP）也是一种常用的快速、特异性强且灵敏的等温DNA扩增技术，无需复杂的实验室设备（Bai等人，2022年；Becherer等人，2020年；Sohrabi等人，2022年）。然而，与在较高恒定温度（60-65°C）下运行的LAMP相比，RPA具有更简单的引物设计，在较宽松的条件下运行，并表现出高灵敏度（Daher等人，2016年；Ivanov等人，2020年；Lv等人，2023年；Batra等人，2024年）。这些因素使RPA成为各种应用中更高效和用户友好的核酸扩增选择。

有多种方法用于显示RPA产物；其中常用的有Exo-RPA和RPA-LFS。与标准RPA不同，RPA-LFS需要生物素或地高辛标记的反向引物、内切酶IV（Nfo）和Nfo探针。探针长度通常为46至52个核苷酸，5’端标记有荧光素，3’端有阻遏物和THF位点（Zhang等人，2024年）。Nfo内切酶IV在THF位点切割探针，使DNA聚合酶能够延伸3’端，从而产生生物素和荧光素标记的扩增子。扩增子通过双抗体夹心法与侧向流动条的检测（T）线相互作用，实现五分钟内的可视化检测。该方法需要在37–39°C的温度下操作，并且设备简单，适用于快速现场检测。图1A展示了RPA-LFS的工作原理。在RT-RPA中，结合了外切酶III（Exo）和Exo探针，通过荧光变化实时监测扩增过程。探针包含一个荧光团和一个附近的淬灭剂，后者暂时抑制荧光信号。3’端附有阻遏物，阻止聚合酶延伸（Tan等人，2022年）。实时检测基于探针在荧光团和淬灭剂之间的THF位点的断裂，如图1B所示。外切酶III在THF或dSpacer位点切割探针，从而分离荧光团和淬灭剂并释放荧光信号（Li等人，2019s）。

假结核耶尔森菌的一个重要毒力标志物是inv基因（Foley等人，2019年；Bui等人，2021年；Ikeuchi等人，2023年），其在假结核耶尔森菌分离株中的存在一致性也得到了确认，而yadA和lcrF在大约88%的分离株中存在，而inv的检出率为100%（Thoerner等人，2003年）。此外，比较基因组测序表明，inv在不同血清型间的遗传变异有限，使其成为比其他高度可变毒力因子更稳健和可靠的分子检测目标（Palonen等人，2012年）。该基因编码的invasin在细菌致病过程中起关键作用，促进细菌附着并侵入真核细胞（Hammerl等人，2021年）。invasin编码的蛋白存在于细菌外膜上，能够特异性识别宿主细胞膜上的各种β1整合素家族蛋白（Galindo等人，2011年；Atkinson和Williams，2016年）。这使细菌能够直接附着在宿主细胞的质膜上，促进细菌与宿主细胞的融合，从而成功侵入细胞。这种invasin介导的途径是假结核耶尔森菌感染和进入宿主细胞的主要机制（Wong和Isberg，2005年）。因此，inv基因不仅作为存在的标志物，还作为病原体毒力潜力的指标（Horisaka等人，2004年）。inv基因的诊断潜力还通过其在环介导等温扩增和多重PCR中的使用得到了进一步证明，显示出其高特异性和灵敏度（Bui等人，2021年；Horisaka等人，2004年）。在本研究中，我们开发并优化了两种独立的、可现场应用的基于RPA的检测方法，通过靶向inv基因来快速准确地检测假结核耶尔森菌。RPA-LFS检测系统通过将RPA与侧向流动条结合构建，而实时荧光（RT-RPA）则使用荧光探针开发。这项研究代表了在食品基质中快速检测假结核耶尔森菌的重大进展，提供了实用且设备要求低的解决方案，适用于早期监测病原体。评估了所建立方法的分析准确性、检测阈值、灵敏度和特异性，以确定其在现场食品安全监测中的应用潜力。

**部分摘录**
**细菌菌株和生长参数**
共使用了10种致病性细菌菌株进行方法开发和验证（表1）。所有菌株均在我们实验室分离，并储存在含有20%甘油的LB肉汤中，温度为-80°C。为了激活菌株，将冷冻库存划线接种到Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，并在37°C下培养。大多数菌株在12-18小时后可见菌落；生长较慢的菌株需要更长时间的培养才能出现明显的单菌落。用无菌工具挑选一个菌落。

**RPA-LFS引物和探针筛选**
RPA反应后，通过凝胶电泳对引物的扩增产物进行可视化分析以进行初步筛选。所有引物对均成功扩增了预期的目标条带，大小分别为203 bp、215 bp、166 bp和169 bp。其中，引物inv-1、inv-3和inv-4显示出较高的引物二聚体存在，这可能导致假阳性结果。相比之下，引物inv-2没有显著的引物二聚体，显示出清晰的信号。

**讨论**
随着生物科学和技术的进步，经常开发出新的细菌检测方法。然而，与病原体相关的食源性疾病仍然对全球公共卫生构成重大挑战（Guldimann和Johler，2018年）。为了检测食品样本中的假结核耶尔森菌，我们建立了并验证了RPA-LFS和RT-RPA检测方法。RPA-LFS方法能够在约10分钟内检测到高浓度的模板，而低浓度的模板则在20-30分钟内被检测到。

**结论**
本研究构建的RT-RPA和RPA-LFS检测方法显示出高检测准确性，与qPCR和实际污染水平一致，在添加了假结核耶尔森菌的食品样本中获得了100%可靠的结果。使用该试剂盒获得的高质量DNA可以在较低浓度下被检测到，而通过煮沸方法获得的细菌DNA也得到了相似的理想结果。这些方法还具有实际优势，其中RPA-LFS检测方法简单、快速且易于操作。

**作者贡献声明**
王申奇：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念化。
杨晓涵：项目管理、资金获取、概念化。
徐鹏新：软件、调查、正式分析。
黄旭轩：可视化、验证。
傅桥琴：资源、数据管理。
阿什拉夫·尼达：撰写——初稿、可视化、方法学、调查、正式分析。
张学华：撰写——初稿、验证、方法学、调查。

**未引用的参考文献**
Li等人，2019年；Palonen等人，2013年；欧洲食品安全局欧洲疾病预防控制中心，2023年。

**数据可用性**
数据可根据请求提供。

**关于生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明**
在准备本手稿期间，作者使用了xAI的Grok、ChatGPT和Grammarly AI来提高语言清晰度和可读性，并协助句子润色。使用这些工具后，作者仔细审查和编辑了内容，并对发表工作的准确性、原创性和完整性负全责。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
本研究得到了中国国家重点研发计划（编号2017YFC1104402）和中国留学基金委（CSC）的初始研究资金的资助和支持。