基于生物膜的封装技术中，益生菌Lacticaseibacillus paracasei NN4-1的蛋白质表达及其分子相互作用机制

《Food Hydrocolloids》：Protein expression and mechanisms of molecular interaction on the biofilm-inspired encapsulation of probiotic Lacticaseibacillus paracasei NN4-1

　　

Fedrick C. Mgomi|张冰鑫|卢春雷|袁蕾|杨振全

江苏扬州大学食品科学与工程学院，中国扬州225127

摘要

受生物膜启发的封装技术最近成为提高益生菌在加工、储存和胃肠道传输过程中存活能力的一种有前景的策略。然而，其背后的分子和结构机制仍不够明确。本研究调查并表征了Lacticaseibacillus paracasei NN4-1在无菌不锈钢试样上以及海藻酸钠凝胶珠内的生物膜形成过程。扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示，封装技术形成了富含胞外聚合物物质（EPS）的密集三维生物膜结构。比较蛋白质组学分析表明，封装技术保留了某些与生物膜相关的特征，同时增加了与长期稳定性和抗压性相关的适应性功能。与生物膜细胞相比，封装后的生物膜细胞中有908种蛋白质表达上调，这些蛋白质主要参与翻译、生物膜形成、中心碳代谢和应激适应过程，这一数量高于封装生物膜与浮游细胞之间的变化（787种）以及浮游细胞与生物膜细胞之间的变化（59种）。分子对接和分子动力学（MD）模拟显示，海藻酸钠与粘附-生物膜相关蛋白之间存在稳定的相互作用，其结合亲和力分别为GAPDH -8.9 kcal/mol、MucBP -7.7 kcal/mol和LPXTG-锚定结构域 -5.9 kcal/mol。这些结果为了解封装如何保持生物膜特性提供了机制上的见解，为开发具有更强存活能力的下一代益生菌递送方法奠定了理论基础。

引言

益生菌是在适量摄入时对宿主健康有益的活微生物。目前，益生菌越来越多地被添加到各种食品中，以促进肠道微生物群落、代谢产物的合成、调节免疫系统并预防病原体（Sarita & Kovaleva, 2025; Yuan et al., 2026）。然而，在加工、储存和通过消化系统的过程中保持其存活能力仍然是一个主要挑战。例如，暴露在恶劣的消化条件下（低pH值、高胆盐和酶）会显著降低它们的存活能力，从而限制了它们对宿主的潜在益处（Sun et al., 2025; Zhang et al., 2025）。因此，有效的保护策略对于确保益生菌能够充分到达目标部位至关重要。

受生物膜启发的封装技术最近作为一种有效的技术出现，用于保护益生菌免受恶劣条件的影响。许多微生物自然存在于生物膜状态，其特征是产生胞外聚合物物质（EPS）。与浮游细胞相比，生物膜相关细胞在不利环境中（如pH值波动、营养缺乏、干燥、抗菌物质和氧化应激）表现出更大的稳定性（Kubota et al., 2008; Ma et al., 2025）。这些特性启发了一种设计，即通过结合各种聚合物（包括海藻酸钠、乳清蛋白、壳聚糖、脂质或其组合）来生产封装的生物膜，以提高它们对恶劣条件的抵抗力（Mgomi et al., 2025, 2026; Razavi et al., 2021）。

例如，封装在钙果胶珠中的类似生物膜的微生物群落释放显示，Lacticaseibacillus paracasei ATCC334对酸应激（pH 1.5）、渗透压应激和冷冻干燥应激具有更强的抵抗力，这归因于EPS的合成（Heumann et al., 2020）。同样，使用海藻酸钠和壳聚糖组合进行的生物膜封装使Lactiplantibacillus plantarum Y42在包括温度、酸性应激、模拟胃肠道条件和冷冻干燥应力在内的恶劣条件下的存活率最高（Gao et al., 2025）。此外，Pediococcus pentosaceus在海藻酸钠凝胶珠中形成的类似生物膜的结构表现出显著的抗压性，在模拟肠液中的存活率为74.28%，在模拟胃条件下的存活率为50.36%。相比之下，未封装的浮游或生物膜细胞则没有存活细胞（Mgomi et al., 2024）。尽管在这一领域做出了许多努力，但大多数研究主要集中在提高益生菌的存活能力、储存稳定性和封装效率上，而对潜在的分子机制了解有限。特别是，关于具体涉及的蛋白质、它们与壁材料（即海藻酸钠）的关系以及相互作用机制知之甚少。

因此，为了填补这些空白，蛋白质组学分析对于提供封装生物膜的分子基础至关重要，以确保对不同表达蛋白（DEPs）进行深入识别和比较分析。此外，蛋白质组学发现为理解益生菌的稳定性和适应应激条件的生物学机制提供了清晰的见解（Mazzeo et al., 2025; Siciliano et al., 2019）。例如，Angelis等人（2015）对L. plantarum DB200进行了比较蛋白质组学分析。通过2D-DIGE分析，发现浮游细胞和生物膜细胞之间的外蛋白组、细胞蛋白组及相关表型特征存在差异，共有115种外蛋白和44种内蛋白。值得注意的是，大多数具有兼职功能的蛋白质在生物膜细胞中的表达量至少增加了2倍。这些蛋白质主要与胞外多糖生物合成、应激耐受性（如ClpP、GroES、GroEL和DnaK）、氧化还原稳态、能量代谢和碳水化合物代谢相关（Angelis et al., 2015），这突显了生物膜形成过程中的代谢和适应性变化。

尽管蛋白质组学发现表明生物膜的形成是由广泛的代谢和应激适应性重编程驱动的，但与封装聚合物（如海藻酸钠）的具体结合机制、结合亲和力、相互作用位点以及分子相互作用对封装基质物理化学行为和益生菌存活率的影响仍知之甚少。这种实验和计算方法的结合为生物膜启发型益生菌封装的整体概念提供了新的见解。此外，最近一项关于L. plantarum的研究表明，海藻酸钠与微藻蛋白（包括Rubisco和C-藻蓝蛋白）具有良好的结合亲和力，从而增强了涂层的完整性和稳定性（Ba?dat & ?zge, 2025）。通过揭示哪些蛋白质介导基质细胞粘附、它们的结合强度以及作用机制，研究人员可以合理设计具有定制成分的封装基质，包括添加特定蛋白质或肽、优化聚合物密度和基质孔隙率以及机械性能。这将提高在应激条件下的存活能力、控制释放，并可能实现靶向递送。据我们所知，很少有研究将蛋白质组学分析与分子对接方法结合起来，以研究生物膜启发型益生菌封装的机制。

因此，本研究旨在阐明L. paracasei NN4-1的生物膜启发型封装中涉及的蛋白质表达水平和相互作用机制。具体来说，该研究旨在了解封装如何影响与生物膜相关的蛋白质表达和分子相互作用，从而提高L. paracasei NN4-1的稳定性和功能性。获得的见解将有助于填补目前限制先进水凝胶封装剂设计的分子空白，实现更强大的益生菌递送系统，用于食品应用。

章节片段

L. paracasei NN4-1的培养条件和生物膜形成

L. paracasei NN4-1在德曼氏罗戈萨夏普（MRS）肉汤（青岛Hope生物有限公司，青岛，中国）中过夜培养后活化，培养温度为37°C。根据Liu, Ge等人的方法（2025），在无菌304级不锈钢试样（1厘米×1厘米×0.1厘米）上评估生物膜的形成。将试样浸入2毫升细菌悬浮液（10^7 CFU/mL）中，然后在37°C下培养24小时。培养后，用清水冲洗三次

L. paracasei NN4-1的生物膜形成的CLSM和SEM分析

在CLSM和SEM分析之前，首先使用结晶紫（CV）染色评估了L. paracasei NN4–1的生物膜形成能力，关键的生物膜特性（包括生物膜覆盖率和粗糙度）已在我们的先前出版物中报道（Mgomi et al., 2026）。该菌株已被证明能在96孔板中形成强生物膜，24小时后的吸光度可达1.574（OD_594 nm）。基于这些发现，L. paracasei NN4–1被确定为强生物膜形成菌株

结论

本研究通过多层面的分析提供了证据，表明受生物膜启发的封装技术显著改变了L. paracasei NN4-1的生理、分子和功能表现，远远超出了简单的细胞固定。高分辨率CLSM和SEM成像显示，封装在多孔珠中的生物膜形成了富含EPS的三维微环境，促进了密集生物膜结构的发育。补充的定量蛋白质组学分析进一步证明了这一点

CRediT作者贡献声明

Fedrick C. Mgomi：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。Bing-xin Zhang：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、数据管理。Chun-lei Lu：撰写——审阅与编辑、软件、方法学。Lei Yuan：撰写——原始草稿、监督、项目管理、正式分析、概念化。Zhen-quan Yang：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、研究、资金支持

利益冲突声明

作者声明他们与本工作没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：32372368）、江苏省重点研发计划（BE2019436-5）、江苏省自然科学基金（BK20210814）、中国博士后科学基金（2021TQ0274）和广东省基础与应用基础研究基金项目（23201910250000448）的财政支持。