通过氮源补充与生物反应器放大提升原壳异养藻在副产物流解液中的蛋白质产量与品质

《Future Foods》：Enhancing protein production and quality of Auxenochlorella protothecoides cultivated in side-stream hydrolysates via nitrogen supplementations and bioreactor scale-up

　　

为推进优质替代蛋白的可持续生产，本研究探究了氮源补充对以啤酒糟和大豆乳清完全制备的混合水解液培养基（H）中异养原壳异养藻（Auxenochlorella protothecoides）蛋白质积累的影响，并进行了可放大培养研究。酵母提取物（YE）补充的水解液培养基（H+YE）获得了最高的生物量（Y_Xmax：24.19 g/L）和蛋白质产量（P_Y：7.21 g/L），其次为鸡骨架水解液（Y_Xmax：19.95 g/L；P_Y：4.95 g/L）、精氨酸（Y_Xmax：16.76 g/L；P_Y：5.05 g/L）和铵盐（Y_Xmax：15.43 g/L；P_Y：3.95 g/L）。凭借丰富的内源性营养物质，H+YE所需的YE补充量降低了33%，同时实现了高于Bold基础培养基（BBM）（Y_Xmax：18.51 g/L；P_Y：6.37 g/L）的Y_Xmax和P_Y，而后者含有相当的葡萄糖（~50 g/L）和氮（~929 mg/L）。将A. protothecoides在H+YE中的培养从摇瓶放大至6.5 L生物反应器，生物量产率（P_Xmax：10.19 g/L/day）翻倍，比生长速率（μ：1.61 day^-1）提升至三倍，倍增时间缩短三倍（0.44 day），同时保持Y_Xmax（22.26 g/L）。所得生物质具有高蛋白质含量和品质，包括28.67%蛋白质、43.00%必需氨基酸（%总氨基酸）、80.39%蛋白质生物可及性和66.72%潜在蛋白质生物可利用性。总体而言，该水解液培养基作为生产目标生物分子的有机基础培养基具有前景，并展示了可放大性。此外，H+YE中观察到的顺序氮摄取揭示了以富含优先氮物种（NH₄⁺、精氨酸）的副产物替代YE的潜力，支持替代蛋白生产中的循环生物经济方法。

全球蛋白质产业面临着以日益减少且利用效率低下的资源满足不断增长需求的重大挑战。人均蛋白质摄入量预计将从2024年的76.6 g/天增长至2033年的79.8 g/天，然而提供超过95%食物的农业用地正在缩减，2001年至2023年间净减少了7500万公顷。这种压力因深刻的低效率而加剧：畜牧业生产消耗了约80%的农业用地，但仅提供全球38%的蛋白质供应。此外，2023年全球13.3%的粮食在收获后、到达消费者之前就已损失，凸显了农业食品副产物作为循环食物生产巨大未开发资源的潜力。在此背景下，微藻因其高面积蛋白质生产力（约30吨/公顷/年，比大豆高25倍）、低耕地需求，以及在不同营养模式下利用多种有机和无机底物生长的能力，成为前景广阔的新型食品原料类别。

在多种具有工业相关性的微藻物种中，原壳异养藻（Auxenochlorella protothecoides）尤为引人注目，因其在美国被归类为"公认安全"GRAS，在欧盟被认定为"非新食品"。该物种的理想特性包括：能以异养方式生长——比自养方式更具生产力且产生视觉吸引力更强的黄色生物质；积累高真实蛋白含量（40-44%，经非蛋白氮校正后）；以及能在多种有机营养源和培养基类型中生长，包括工业食品副产物。基于这一潜力，前述研究开发了一种完全由大豆乳清SW和啤酒糟BSG组成的混合水解液培养基，以提高微藻基食品生产的资源效率和经济可行性。该SW-BSG水解液培养基内源性富含葡萄糖，无需额外补充即可支持异养A. protothecoides生长，实现了22.2 g/L的生物量浓度和7.1 g/L/day的生产力，与改良Bold基础培养基BBM中的生长相当。这表明水解液培养基是将食品工业副产物升级为靶标生物分子的有前景的基础培养基。然而，其高碳氮比C:N（53:1）有利于脂质生物合成，导致26.6%干质量脂质和仅15.2%干质量蛋白。因此，尽管副产物水解液可减少对作物衍生葡萄糖的依赖并提高循环性，但其不平衡且复杂的营养谱可能使代谢偏离蛋白质积累，使氮可利用性成为引导碳通量朝向蛋白质生物合成的关键瓶颈。

尽管氮可利用性已被确认为关键瓶颈，但选择适当的氮源以在副产物水解液中生产富含蛋白质的原壳异养藻仍待解决。先前研究已优化了异养微藻蛋白质积累的氮补充，但主要集中于小球藻Chlorella sp.和眼虫Euglena gracilis等物种，以及含有纯净确定碳源和氮源的常规培养基。这些系统与含有混合糖、多样氮物种及其他副产物衍生化合物的SW-BSG水解液不同，后者可能改变营养摄取和碳分配。因此，该培养基中的氮补充不能仅基于总氮添加量或C:N调整，而需要一种同时考虑水解液组成复杂性和A. protothecoides代谢的物种及培养基特异性策略。在此背景下，纯精氨酸和富含精氨酸的鸡骨架水解液等替代氮源具有相关性，因为精氨酸可能是A. protothecoides的优先氮物种。因此，本研究的创新性在于评估常规和替代氮源以改善完全以副产物衍生的SW-BSG水解液培养基上生长的A. protothecoides的蛋白质积累。

物种及培养基特异性的氮补充策略可改善A. protothecoides的蛋白质积累，但所得生物质的实用价值还取决于可放大性和蛋白质品质。可放大性至关重要，因为培养过程必须适应大规模操作，同时保持生产力和成本效益。蛋白质品质同样重要，其定义为蛋白质生物可及性和生物可利用性——可能因刚性细胞壁的存在而降低，以及必需氨基酸EAA含量。A. protothecoides通常缺乏必需氨基酸蛋氨酸，一些商业蛋白性A. protothecoides生物质还被报道缺乏其他必需氨基酸，包括赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。因此，评估可放大性和蛋白质品质对于确立副产物水解液培养的蛋白性A. protothecoides生物质的实用价值和适用性是必要的。

研究人员评估了不同氮源补充至混合SW-BSG水解液培养基对蛋白质积累、工艺性能（如生物量和蛋白质滴度、产量和速率）及营养摄取模式的影响，并与BBM进行了比较。随后，研究人员探索了生物反应器培养，并通过氨基酸谱分析、蛋白质生物可及性和潜在生物可利用性评估了蛋白质品质。本研究旨在揭示水解液培养基作为促进其他生物过程循环性的基础培养基的前景；评估A. protothecoides作为替代蛋白质来源的蛋白质品质和可放大性；并提出可转化为高微藻蛋白质产量和品质的氮素副产物，以促进生物循环经济。

研究所采用的关键技术方法包括：首先，从新加坡当地供应商处获取啤酒糟和大豆乳清，通过酸水解制备25% SW-75% BSG水解液培养基，其中BSG采用两批混合以保证一致性；其次，采用德国哥廷根大学保藏的原壳异养藻SAG 211-7a菌株，在改良BBM中进行两级传代预培养后，分别于500 mL摇瓶（100 mL工作体积）和6.5 L生物反应器（3.2-3.4 L工作体积）中进行黑暗异养培养，生物反应器配备pH自动控制（2 M NaOH维持pH 6.5）、溶解氧控制（空气/氧气微孔通气，50%饱和度）及Rushton涡轮搅拌（500 rpm）；第三，向水解液培养基中分别补充20 g/L酵母提取物、2.96 g/L精氨酸、3.19 g/L碳酸铵或9.16 mL鸡骨架水解液，使氮浓度标准化至约929 mg/L；第四，采用干重法监测生长，计算最大生物量浓度X_max、最大生物量产率P_Xmax、最大生物量产量Y_Xmax、生物量产率系数Y_X/S、比生长速率μ和倍增时间t_d；第五，采用Kjeldahl法（AOAC 2001.11）和总有机碳-总氮分析仪（TOC-TN）测定总氮，以氮-蛋白转换系数k=4.78计算粗蛋白含量，以无水氨基酸总和估算真实蛋白含量；第六，采用甲磺酸、过甲酸氧化和HCl加1%苯酚三种水解法处理样品，经日立LA8080高速氨基酸分析仪进行氨基酸组成分析；第七，采用改良INFOGEST 2.0静态体外胃肠消化模型，通过邻苯二甲醛OPA法测定消化液和透析液中的氨基基团，计算蛋白质生物可及性和潜在生物可利用性；第八，所有统计分析基于生物学重复（摇瓶培养n=2或3，生物反应器为三次独立运行），数据以平均值±标准差表示。

研究结果部分，首先关于不同氮源对异养A. protothecodes的影响，研究人员通过向水解液培养基中补充不同氮源并比较其生长性能和粗蛋白含量，发现酵母提取物补充最有效促进生长，鸡骨架水解液次之，精氨酸补充影响最小，而碳酸铵抑制生长。其中最大生物量产量顺序为：H+YE > H+CCH > H/H+Arg > H+(NH₄)₂CO₃。酵母提取物因富含维生素和微量元素特别是硫胺素（A. protothecoides为硫胺素营养缺陷型）、磷和锌，最有效地促进了生物量积累，并因氨基酸的缓冲效应及可能的活性碳酸酐酶作用而维持较稳定的pH。鸡骨架水解液因丰富的矿物质含量特别是磷而改善生物量，但因维生素缺乏而效果不及酵母提取物。精氨酸和碳酸铵因缺乏补充性维生素和矿物质而未能改善生长，且铵离子在高浓度下对微藻生长具有毒性。在蛋白质产量方面，所有氮源补充均提高了粗蛋白含量，其中精氨酸补充最显著，约增加两倍，归因于精氨酸通过高亲和力特异性载体的直接快速吸收和高效利用。然而综合考虑生物量和粗蛋白含量的蛋白质产量，H+YE因酵母提取物的综合营养支持而实现最高蛋白质产量（6.40±0.03 g/L），故选择20 g/L酵母提取物进行后续实验。

在验证水解液培养基与酵母提取物补充效果的研究中，研究人员比较了非补充H培养基、H+YE和BBM+YE（含等量葡萄糖和可同化氮）中的A. protothecoides生长，确认酵母提取物促进生长的有效性，并验证了水解液培养基替代BBM的优越性。结果显示H+YE中的A. protothecoides表现出比BBM+YE更高的Y_Xmax和P_Xmax，可能因为H+YE含有更高比例的 energetic 效率高的NH₄⁺ 和BBM+YE中缺乏的必需微量元素如锰。H+YE仅需20 g/L酵母提取物即达到高于需30 g/L酵母提取物的BBM+YE的蛋白质产量和氮利用效率，证实了以富含营养的厌水解液培养基替代BBM以增强资源再利用的合理性。与现有文献相比，本研究获得更高的蛋白质产量和氮利用效率，凸显了异养A. protothecoides在H+YE中作为蛋白质源的潜力。

关于不同培养条件下A. protothecoides的氮物种消耗模式，研究人员通过分析H、H+YE和BBM+YE培养基中游离氨基酸和氨的消耗动态，揭示了A. protothecoides对不同氮物种的优先利用顺序。结果显示H培养基中游离氨基酸和NH₄⁺在静止期前即 depleted，凸显其氮 limited 特性。NH₄⁺和精氨酸为优先氮源，均在第1天内被快速消耗，分别通过CpAMT1转运蛋白和精氨酸特异性高亲和力载体介导。其他氨基酸的消耗在H培养基中最快，可能因低C:N比诱导了氮同化相关酶活性；BBM+YE中因微量NH₄⁺缓解了L-氨基酸氧化酶抑制而较快利用；H+YE中因高NH₄⁺浓度可能抑制了L-氨基酸氧化酶，延缓了其他氨基酸的吸收直至第2天NH₄⁺耗尽。赖氨酸在精氨酸耗尽后即被显著摄取，可能因为精氨酸特异性载体转而介导赖氨酸转运。天冬氨酸和谷氨酸为最不偏好氮源，可能因相应的氧化酶活性有限而残留至培养结束。

在生物反应器放大培养方面，研究人员将H+YE中的A. protothecoides培养从摇瓶放大至6.5 L生物反应器，评估了蛋白性A. protothecoides生产的放大性能。三次独立生物反应器培养（B1、B2、B3）的结果表明，生物反应器的生长性能和生物质组成与摇瓶培养相当，X_max、Y_Xmax、Y_X/S、真实蛋白质产量和蛋白质产率系数范围分别为22.53-24.42 g/L、21.46-23.56 g/L、0.58-0.64 g生物量/g利用碳底物、6.31-7.27 g/L和5.10-6.14 g/L，与摇瓶培养的25.06±1.07 g/L、24.19±1.07 g/L、0.57±0.03 g生物量/g利用碳底物、6.59±0.13 g/L和5.25±0.10 g/L相当。生物反应器中生长动力学显著改善：最大生物量产率翻倍、比生长速率提升至三倍、倍增时间缩短约三倍，归因于生物反应器更高效的营养和氧气分布、精确的温度和pH控制。B3的生物反应器因种源污染延迟接种而采用早期静止期种源，导致生长动力学改善略逊于B1和B2。

在蛋白质品质评估方面，研究人员将H+YE培养的A. protothecoides与商业化蛋白样本进行系统比较，以确定其作为替代蛋白的竞争力。结果显示，H+YE培养的A. protothecoides真实蛋白含量（28.01-29.79%）低于商业A. protothecoides样本（37.94%），可能因高碳含量导致同时期脂质积累、优先氮物种耗尽限制蛋白质生物合成速率、以及收获时相较晚所致。改进策略包括以NH₄OH替代NaOH进行pH控制、以富含优先氮物种的替代有机氮源取代酵母提取物、以及实施连续培养维持指数生长期。必需氨基酸含量方面，生物反应器培养的A. protothecoides（约43%）与鹰嘴豆蛋白和豌豆蛋白相当，高于大豆蛋白，显著高于商业A. protothecoides（32.17%）；所有样本均缺乏蛋氨酸，但A. protothecoides的蛋氨酸含量高于植物蛋白。亮氨酸和赖氨酸为最丰富的必需氨基酸，H+YE培养的样本亮氨酸含量高于商业生物质，具有更强的肌肉蛋白质合成促进潜力。蛋白质生物可及性和潜在生物可利用性方面，H+YE培养的A. protothecoides分别达到77-85%和64-72%，高于商业化生物质（51%和32%）、植物蛋白（58-65%和39-46%）和蛋清蛋白（53%和38%），尽管蛋清蛋白理论上为最高品质蛋白，但本研究采用天然折叠状态限制酶切位点暴露。

在副产物培养基的未来机遇方面，研究人员分析了SW-BSG水解液作为基础培养基的成本优势及完全替代昂贵营养物的策略。该培养基因提供内源性氮而允许酵母提取物补充量降低33%（20 g/L vs 30 g/L），直接降低原材料成本。通过战略性地使用酵母提取物绘制氮偏好图谱，揭示了精氨酸、赖氨酸和亮氨酸的优先利用顺序，指导选择富含这些特定氨基酸的副产物如鱼类或禽类加工水解液作为替代。鸡骨架水解液验证了该策略的有效性，其略逊于酵母提取物的表现归因于微量营养素缺乏而非氮源质量本身。未来可通过混合互补性副产物（如富含维生素和磷的鸡内脏）克服微量营养素不足，并控制批次间异质性。最终实现完全替代需进行全面的生命周期评估和技术经济评估。

结论部分翻译：25% SW-75% BSG水解液培养基（H）作为酵母提取物补充的基础培养基优于其常规对应物（BBM），在减少33%酵母提取物补充量的同时增加了原壳异养藻的蛋白质积累。在H+YE中于生物反应器规模培养的蛋白性原壳异养藻与摇瓶规模相比显示出改善的生长动力学，并且尽管略有蛋氨酸缺乏，其相对于植物蛋白表现出更优的必需氨基酸谱。值得注意的是，该生物反应器培养的生物质即使具有顽固的细胞壁，仍表现出可观的蛋白质生物可及性和潜在生物可利用性。此外，观察到的原壳异养藻顺序性氮摄取为以富含蛋白质副产物替代酵母提取物提供了见解，可能通过循环生物经济框架提高资源效率和蛋白质产量。总体而言，本研究展示了一条有前景的资源高效型废弃物增值途径：完全在副产物水解液上培养异养原壳异养藻以生产高品质替代蛋白，从而减少对常规农业的依赖。