综述：精准发酵生产无动物源酪蛋白：技术挑战与展望

《TRENDS IN FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY》：Animal-free caseins by precision fermentation: technical challenges and perspectives

　　

酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，可组装形成胶束结构，为乳制品的多种功能特性和营养特性提供结构基础。重组DNA技术已实现部分乳清蛋白的高效微生物生产，但酪蛋白的表达难度显著更高。酪蛋白对蛋白水解的敏感性、自聚集倾向及翻译后修饰特征，均增加了其异源生产的复杂性。本综述系统总结了不同宿主系统中微生物表达酪蛋白的研究现状，重点关注分泌型酪蛋白生产——该策略虽能为下游加工带来优势，但高效实现难度较大。研究人员讨论了蛋白酶缺失、激酶共表达及磷酸模拟酪蛋白变体等策略，作为提升产量与功能特性的潜在路径。上述发现既凸显了通过精准发酵生产适用于食品应用的重组酪蛋白的前景，也明确了仍需克服的障碍。展望未来，宿主工程、分泌效率提升、发酵与下游加工的可扩展性优化及蛋白质功能特性改良，将是实现工业化规模生产的关键，也将推动重组酪蛋白成为替代乳制品的可行配料。

1. 引言

畜牧业是温室气体排放的主要来源之一，其中乳制品的环境影响尤为突出，奶酪的单位蛋白质温室气体排放量显著高于禽肉、养殖鱼类、鸡蛋等动物源性食品。全球对动物源性食品的需求持续增长，叠加动物福利关切，推动消费者寻求可持续的动物源性产品替代方案。然而植物基乳替代品在营养与感官特性上均难以匹配牛乳：其蛋白质含量普遍低于1%，远低于牛乳的3%以上；蛋白质消化率校正氨基酸评分（DIAAS）亦显著偏低，且钙的生物可及性较差。酪蛋白作为牛乳中占比约80%的蛋白质组分，是决定酸奶、奶酪等产品结构与质地的核心成分，其独特的胶束组装特性是植物蛋白难以复现的关键原因。

精准发酵通过将目标基因导入微生物宿主，可在无动物养殖条件下生产结构与天然动物蛋白高度相似的蛋白质，其中分泌表达因简化下游纯化流程而更具优势。目前乳清蛋白已通过该路径实现商业化，但酪蛋白的重组生产仍面临诸多固有挑战，尤其是丝氨酸残基磷酸化等翻译后修饰对其钙结合能力与胶束形成的决定性作用。本综述从生物技术视角系统梳理不同微生物宿主中重组酪蛋白的表达研究，填补现有文献对该领域技术瓶颈分析的空白，为替代乳制品的功能性配料开发提供支撑。

2. 牛酪蛋白的特性

牛酪蛋白包含α_S1-、α_S2-、β-和κ-四种亚型，分子量均为20-25 kDa，共同特征为无稳定折叠构象，属于固有无序蛋白（IDP）。高脯氨酸含量阻断了α-螺旋与β-折叠的形成，使其呈现动态聚脯氨酸-II（PPII）螺旋构象，导致疏水残基大量暴露，赋予其独特的结构与功能属性。

酪蛋白的核心翻译后修饰包括磷酸化与糖基化。磷酸化发生于所有亚型，位点集中于Ser/Thr-Xaa-Glu/Asp/pSer基序，负电荷磷酸基团可结合Ca²⁺，通过与胶体磷酸钙的相互作用介导酪蛋白分子间的钙桥连接，是其高钙生物可及性的结构基础——消化过程中释放的磷酸肽可将钙维持至远端肠道的可溶状态。糖基化仅存在于κ-酪蛋白，以O-糖基化形式连接四糖结构（半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、N-乙酰神经氨酸）。此外，α_S2-与κ-酪蛋白含半胱氨酸残基，可形成分子内或分子间二硫键，因此分析中需采用还原条件。

酪蛋白在乳腺中自发组装为胶束结构：α_S1-、α_S2-与β-酪蛋白构成胶束核心，与胶体磷酸钙纳米簇结合；κ-酪蛋白的C端糖基化区域位于胶束表面，通过空间位阻与静电排斥维持胶束胶体稳定性。凝乳酶切割κ-酪蛋白的Phe126-Met127位点去除亲水性C端，破坏胶束稳定性并形成凝乳，该机制是奶酪生产的核心步骤。胶束融合形成的副酪蛋白凝胶网络决定了奶酪的拉伸性、熔化性等质构特性，而植物蛋白无法复制这一微观结构，导致现有植物基奶酪主要依赖淀粉填充，质构与营养均存在缺陷。综上，酪蛋白的结构特性及其胶束功能解释了植物基乳制品在感官与质构上难以匹配传统乳制品的根本原因，而精准发酵生产的酪蛋白有望突破这一瓶颈。

3. 酪蛋白的精准发酵

3.1 重组酪蛋白生产的分子与功能考量

酪蛋白的固有无序特性使其蛋白酶切位点充分暴露，对宿主内源性蛋白酶高度敏感；其自聚集倾向可能在微生物体内形成超分子组装体，干扰分泌过程——哺乳动物乳腺细胞演化出适配的分泌机制，而微生物缺乏相应的生理调控通路。翻译后修饰是实现天然功能的前提：磷酸化是酪蛋白胶束形成、酸凝与酶凝的必要条件，若应用于非结构化食品（如乳化剂、发泡剂），非磷酸化变体可能满足需求，但奶酪等需胶束组装的产品必须实现等效磷酸化。体外激酶催化磷酸化的策略虽可行，但会增加工艺复杂度与成本。

3.2 精准发酵的基本原理

精准发酵通过基因工程微生物合成目标分子，核心环节包括菌株构建、宿主选择、发酵过程与下游加工。菌株构建需将含目标基因、启动子、终止子及信号肽的表达载体导入宿主，基因组整合因遗传稳定性高更适用于工业生产。宿主分为原核（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）与真核（酿酒酵母、毕赤酵母）两类：大肠杆菌生长快、遗传工具成熟，但缺乏真核翻译后修饰能力，且胞内表达易形成包涵体，内毒素需严格去除；枯草芽孢杆菌为GRAS（公认安全）菌株，分泌能力强且无内毒素；酿酒酵母可实现分泌与真核修饰，但存在过度甘露糖基化风险；毕赤酵母支持高密度培养，磷酸化修饰更接近天然，是高价值蛋白表达的常用平台。发酵过程需通过生物反应器精确控制pH、温度、溶氧等参数，下游加工需根据表达位置设计：分泌表达可利用酪蛋白在pH 4.6附近沉淀的特性简化分离，而胞内表达需细胞破碎与多步纯化，成本显著更高。实验室常用的亲和标签纯化策略因引入非天然元件，不适用于食品级生产。

3.3 现有酪蛋白表达研究概述

现有研究覆盖大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母与毕赤酵母四类宿主。大肠杆菌中，早期研究多实现胞内表达，产量最高达1.45 g/L（以木质纤维素水解物为底物），但普遍存在包涵体形成与蛋白酶降解问题；分泌尝试多采用PelB或OmpA信号肽，但分泌效率极低，多数蛋白滞留于胞内或周质空间。磷酸化改造方面，共表达人酪蛋白激酶II（CKII）可实现人β-酪蛋白的全位点磷酸化，而牛β-酪蛋白并非CKII的理想底物，需通过理性设计引入磷酸化基序；近期研究利用枯草芽孢杆菌Prk或YabT激酶实现了牛α_S1-酪蛋白的高效磷酸化，磷酸模拟突变体也可部分恢复钙结合能力。

枯草芽孢杆菌的胞内表达同样形成包涵体，高密度发酵产量为56.9 mg/L。酿酒酵母中，蛋白酶缺陷株可减少降解，但分泌效率极低（最高0.6 mg/L），且β-酪蛋白会被酵母进行非天然O-糖基化；κ-酪蛋白的C端酪蛋白巨肽（CMP）在毕赤酵母中分泌产量可达2.5 g/L，显示亲水性片段更易分泌。毕赤酵母中，牛β-酪蛋白虽可实现胞内高水平积累（0.7-1.0 g/L），但分泌量不足胞内的0.005%，且磷酸化水平与天然蛋白一致。

4. 讨论

4.1 酪蛋白精准发酵的应用价值

除环境效益外，精准发酵可通过调控酪蛋白亚型比例定制胶束特性，优化乳制品的质构与消化动力学；人源酪蛋白的生产可提升婴幼儿配方奶粉的营养适配性；序列工程还可开发低致敏性或针对代谢疾病患者的特医食品配料。

4.2 酪蛋白表达挑战与潜在解决方案

核心挑战集中在三方面：一是蛋白水解，蛋白酶缺陷株可降低降解，但可能影响宿主生长，包涵体的复性需使用变性剂；二是磷酸化，细菌宿主需通过激酶共表达实现，激酶选择需匹配酪蛋白物种亚型，磷酸模拟变体是无需修饰的替代方案；三是糖基化，酵母的非天然糖基化可能改变酪蛋白的电荷与亲水性，需通过宿主工程调控糖基化途径，使其接近哺乳动物模式。

分泌效率低是另一关键瓶颈：酪蛋白作为乳腺高度适应的分泌蛋白，其高效分泌依赖特异性分子伴侣与组装时序，微生物的分泌通路无法适配其固有无序特性与疏水特征，未折叠蛋白反应（UPR）与内质网相关降解（ERAD）通路可能被激活，导致蛋白滞留或降解；酪蛋白可能自身作为分子伴侣辅助分泌，而酵母缺乏这一调控机制。

4.3 工业化实施的商业化挑战

发酵放大过程中，大型反应器的梯度分布会导致产量下降；碳源选择需平衡成本与可持续性，毕赤酵母可利用生物柴油副产物甘油，木质纤维素水解物是有潜力的廉价底物；氮源的传统Haber-Bosch工艺氨盐环境足迹较高，农业侧流回收氮是未来方向。监管层面，重组酪蛋白属于新型食品，需符合欧盟（EU）2015/2283等 regional 法规，安全性评估与消费者接受度将决定其商业化进程。

5. 结论

酪蛋白精准发酵已成为学界与产业界的关注焦点，现有宿主各有优劣，核心障碍包括蛋白酶敏感性、细菌宿主磷酸化缺失与分泌效率低下。激酶共表达、磷酸模拟变体与蛋白酶缺陷株改造已取得初步进展，未来需结合宿主工程、新宿主探索及酪蛋白变体的功能筛选，持续推动无动物源酪蛋白在可持续乳制品中的应用。