已验证的LC–MS/MS方法用于定量人类粪便样品中的酚酸、木脂素和肠木脂素

《ACS Nutrition Science》：A Validated LC–MS/MS Method for Quantifying Phenolic Acids, Lignans, and Enterolignans from Human Fecal Samples

　　

人类肠道是众多影响健康的小分子的栖息地。其中三类重要的分子是酚酸（phenolic acids）、木脂素（lignans）和肠木脂素（enterolignans），它们与抗炎、抗氧化作用以及预防癌症、心血管疾病和神经退行性疾病相关。这些分子在肠道中的丰度及其生物学意义促使研究人员开发并验证了本文所述的LC–MS/MS方法，该方法提供了一种简单、稳健、高通量的方法，可同时定量人类粪便样品中22种酚酸、木脂素和肠木脂素。简便的样品制备和短的分析时间（每个样品5分钟，而类似方法需要7.8–28分钟）实现了高通量。灵敏度提高了16倍，使得能够定量那些通常通过现有方法无法检测到的木脂素。

**论文解读**

**研究背景及问题**

人类肠道微生物群产生的代谢物正日益被认为是健康的关键调节因子。其中，酚酸（phenolic acids）、木脂素（lignans）及其由肠道菌群转化生成的肠木脂素（enterolignans）是一类重要的植物多酚衍生物，具有抗氧化、抗炎、抗高血压和抗癌等健康促进作用。然而，现有定量方法存在若干局限：多数方法仅能单独定量酚酸、木脂素或肠木脂素中的一类，无法在同一次分析中覆盖全部三类；分析时间较长（7.8–28分钟不等）；对木脂素和肠木脂素的灵敏度不足，导致许多低丰度木脂素无法被检测或定量；此外，粪便样品含水量差异大，缺乏标准化归一化方法，影响个体间及时间点间的可比性。为解决这些问题，研究人员旨在开发一种同时定量22种目标物（15种酚酸、5种木脂素、2种肠木脂素）的LC–MS/MS方法，并依据FDA指南进行全面验证，以实现简便、稳健、高通量且可比的定量分析。该研究成果发表在《ACS Nutrition Science》。

**主要技术方法**

研究人员采用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）技术，在多反应监测（MRM）和负电喷雾电离（ESI^?）模式下运行。样品前处理采用液-液萃取（甲基叔丁基醚，MtBE），所有步骤在玻璃容器中进行以避免塑料微离心管（MCT）的浸出物干扰。使用稳定同位素标记内标（¹³C₃-咖啡酸、¹³C₃-rac-肠内酯、d₆-rac-开环异落叶松树脂酚）校正基质效应。校准样品质控样品通过2倍梯度稀释制备。方法验证严格遵循FDA指南，评估了灵敏度、选择性、基质效应、准确性、精密度、稳定性及回收率。粪便样品来自10名健康志愿者（美国加州大学尔湾分校伦理批准方案#20195091），经冻干后以干重归一化浓度。

**研究结果**

**方法验证（Method Validation）**
- **灵敏度（Sensitivity）**：优化色谱条件后，酚酸的定量下限（LLOQ）为0.98–3.91 nM，木脂素和肠木脂素的LLOQ为0.24–0.98 nM。与已有方法相比，灵敏度提升16倍，使得低丰度木脂素得以可靠定量。
- **选择性（Selectivity）**：通过MRM及色谱分离实现所有分析物的独特鉴定。少数同分异构体（如3-(3-羟苯基)丙酸与3-(4-羟苯基)丙酸）存在交叉信号，但基线分离确保了准确定量。
- **基质效应（Matrix Effects）**：大部分分析物的基质效应可忽略（±5%以内）。仅香草酸（vanillic acid）、罗汉松树脂酚（matairesinol）和肠二醇（enterodiol）在低浓度（10 nM）时出现轻微离子增强（≤30.1%），其他浓度下效应不显著。研究人员发现塑料微离心管（MCT）会释放干扰信号（如阿魏酸、松脂醇等），其浓度可达LLOQ的2.6–94倍，因此所有前处理均使用玻璃器皿以排除干扰。
- **准确性、精密度与稳定性（Accuracy, Precision, and Stability）**：所有分析物的准确性（相对误差RE）和精密度（相对标准偏差RSD）均符合FDA标准（低浓度±20%，其他浓度±15%），多数在±10%以内。稳定性测试中除香草酸在800 nM浓度下经3次冻融和长期冻存后RE略超限（?18.4%、?19.3%）外，其余均合格。
- **回收率（Recovery）**：大部分分析物回收率在95%–105%之间。二氢咖啡酸（dihydrocaffeic acid）回收率为86.8%，芥子酸（sinapinic acid）为111.6%，均与类似方法相当。
- **人类粪便样品分析（Human Fecal Sample Analysis）**：成功对10名健康志愿者粪便样品进行定量，所有22种分析物均有检出或部分低于定量限。3-(3-羟苯基)丙酸浓度最高（0.77–41.64 nmol/g干重），与文献报道一致。木脂素浓度较低（0.01–0.37 nmol/g），而肠木脂素浓度比木脂素高最高达237倍（肠二醇0.52–6.71 nmol/g；肠内酯0.65–87.78 nmol/g），符合肠道菌群转化前体为产物的代谢途径。

**总结讨论**

该方法的突出优势在于：单次进样同时定量三类22种目标物；分析时间仅5分钟/样品，远短于现有方法的7.8–28分钟；采用冻干粪便样品干重归一化，消除了个体间水分差异的混淆效应；灵敏度显著提高，使以往无法检测的木脂素得以可靠定量；使用玻璃器皿避免了塑料浸出物的干扰。该方法的准确性、精密度、回收率和稳定性均满足FDA要求，可为肠道微生物组研究中酚类代谢物与疾病预防的关联分析提供可靠工具。

**研究结论**（翻译原文结论部分）

本文所述的经验证的LC–MS/MS方法被设计为简单且稳健，旨在促进那些试图阐明多酚代谢物在人类健康和疾病中作用的肠道微生物组研究。该方法通过同时定量这些饮食和肠道微生物来源的代谢物，且每次进样分析周期短至5分钟，推动了人类粪便样品中酚酸、木脂素和肠木脂素定量领域的发展。重要的是，由于分析物浓度以冻干粪便质量为基准进行归一化，该方法允许个体间及时间点间的直接比较，从而消除了由含水量差异带来的混淆效应。该方法能够可靠定量许多通常在人类粪便样品中丰度较低的木脂素，而现有方法常将其报告为未检测或不可定量。总之，这种准确、灵敏的同时定量一组健康促进分子的方法，将促进未来那些量化并调控其肠道细菌生物合成以实现疾病预防的研究。