硅化合物（Silicon Compounds）体外（In Vitro）及温室评价其对豌豆Ascochyta blight病原的抑制效应及对豌豆生理响应的影响

《Journal of Crop Health》：In Vitro and Greenhouse Evaluation of Silicon Compounds Against Ascochyta Blight Pathogens and Physiological Responses in Pea

　　

Ascochyta blight是危害全球豌豆（Pisum sativum）作物的严重病害，由Ascochyta、Phoma及Boeremia属不同种真菌引起。本研究对采自哥伦比亚中安第斯山区豌豆作物Ascochyta blight病斑的分离株进行了鉴定，并评价了硅（Si）化合物[硅酸钾（KSi）与硅酸钙（CaSi）]对Ascochyta blight分离株菌丝生长、接种后病害进展及豌豆植株生理指标（气孔导度、生长量和叶绿素含量）的交互作用。体外试验（E1）中，研究人员测试了两种Si化合物对3株病原分离株生长的影响；温室试验（E2）中，用KSi处理豌豆植株并接种AMn01与AMn03两株分离株。研究人员从感染豌豆叶片中获得3株分离株（AMn01、AMn02和AMn03），经分子鉴定均属Didymella属，其中AMn01与Didymella lethalis亲缘关系密切，AMn03与Didymella pinodella亲缘关系密切。E1结果显示KSi和CaSi均抑制3株分离株的菌丝生长，KSi抑制率（32%）高于CaSi（12%）。E2结果显示KSi特别是土壤浇灌处理（KSi?S）降低了接种AMn01（KSi?S病情严重度2.49 vs. 接种不施Si对照cp? 2.67）和AMn03（KSi?S 1.92 vs. cp? 2.44）植株的病害严重度；KSi?S处理的气孔导度（213.66 mmol CO? · m?2 · s?1）较cp?植株（136.14 mmol CO? · m?2 · s?1）有所提高。上述结果表明D. pinodella和D. lethalis也可作为哥伦比亚豌豆Ascochyta blight的致病因子，施用Si特别是KSi有助于病害管理及改善植株生理机能，尚需田间试验进一步验证Si在可持续豌豆生产中的作用。

论文解读——《In Vitro and Greenhouse Evaluation of Silicon Compounds Against Ascochyta Blight Pathogens and Physiological Responses in Pea》（发表于Journal of Crop Health）

一、研究背景与立题依据

豌豆（Pisum sativum）是世界重要豆类作物，Ascochyta blight（炭疽疫病/黑斑病）是由Ascochyta、Phoma和Boeremia属多种真菌组成的病害复合群引起的坏死营养型叶部病害，可致减产达75%。传统防控依赖杀菌剂和抗病品种，但病原菌组成具地域差异且杀菌剂存在环境压力。硅（Silicon, Si）作为有益元素可通过在植物表皮形成聚合物理屏障、诱导病程相关蛋白（pathogenesis?related proteins, PR proteins）如几丁质酶（chitinase）和β?1,3?葡聚糖酶（β?1,3?glucanase）及增强抗氧化系统来提高植物抗真菌侵染能力，并在多种作物上有体外抑菌和减轻病害的报道。然而，关于Si对豌豆Ascochyta blight病原Didymella/Ascochyta复合群菌丝生长的体外抑制效应，以及不同Si源（钾/钙硅酸盐）和施用方式（土壤浇灌vs叶面喷施）对豌豆接种后病害发展及光合生理影响的系统研究较少，且哥伦比亚安第斯山区该病病原种类尚不明晰。因此研究人员假设当地主要病原并非经典报道的Didymella pisi或Mycosphaerella pinodes，并假设外源Si可减轻Ascochyta blight危害并改善豌豆生理，开展本项研究以鉴定病原、评价Si体外抑菌活性及温室防效与生理效应。

二、主要关键技术方法

研究人员于哥伦比亚昆迪纳马卡省Mosquera的Vizcaya豌豆田间采集典型Ascochyta blight病叶，经组织分离纯化获得3株形态学差异分离株（AMn01、AMn02、AMn03），通过柯赫法则验证致病性，并提取基因组DNA采用ITS、RPB2、BTUB及28S rDNA多位点PCR扩增测序构建最大似然法（Maximum Likelihood）系统发育树进行种属鉴定。体外试验（E1）将KSi（硅酸钾Misil?K，240 g Si·L?1）和CaSi（硅酸钙Tricho?sil enmienda，136 g Si·L?1）按大田推荐剂量加入PDA培养基，接种5 mm菌丝块，测定7、14、21天菌落直径，计算菌丝线性生长速率（mycelial linear growth rate, MLGR）和菌丝生长抑制率（mycelium growth inhibition, MGI%），并以未加Si为对照。温室试验（E2）播种Vizcaya豌豆，设土壤浇灌KSi（KSi?S）、叶面喷施KSi（KSi?F）、接种不施Si对照（Cp?）及不接种不施Si健康对照（Cp?），于14、21、28天播种后（DAS）施KSi，35 DAS接种AMn01或AMn03菌株PDA菌饼，定期拍照用ImageJ分析病斑面积并计算病害进展曲线下面积（area under the disease progress curve, AUDPC）和防治效果，同时测定株高相对生长速率（relative growth rate, RGR）、气孔导度（stomatal conductance, g_s）、相对叶绿素含量（SPAD）、叶温及非光化学淬灭（non?photochemical quenching, NPQt），完全随机设计，ANOVA及Tukey法多重比较（p≤0.05）。

三、研究结果

First Experiment (E1): Effect of Silicon on Mycelial Growth of Didymella Spp. Under In Vitro Conditions——Didymella Spp. Isolates Obtained from Pea Plants

3株分离株在PDA上呈白色棉絮状菌丝，正面/反面颜色及生长模式不同，产生厚垣孢子（chlamydospores）但不产分生孢子器（pycnidia），回接Vizcaya豌豆诱发典型Ascochyta blight症状并重新分离得到相同菌落。ITS等序列比对及系统发育分析显示3株分离株均属Didymella属，AMn01与D. lethalis（CBS_103.25）最近缘，AMn03与D. pinodella（CBS_351.34）最近缘，AMn02介于二者间，此为首次报道D. pinodella和D. lethalis可能为哥伦比亚豌豆Ascochyta blight致病菌。

Effect of Silicon on Mycelial Growth of Didymella Spp.

KSi和CaSi均显著降低3株Didymella分离株的菌丝径向生长、MLGR及菌丝生长曲线下面积（area under the mycelial growth curve, AUMGC）（p<0.05）。KSi对AMn01和AMn03的MGI%在7、14、21天分别为约31.6%~35.4%和36.3%~41.9%，显著高于CaSi（约12%~22%），AMn02对两Si源反应相近且抑制较弱，因此后续温室试验选用AMn01和AMn03。

Second Experiment (E2): Effect of Silicon on Ascochyta Blight Under Greenhouse Conditions——Effect of Silicon on the Development of Ascochyta Blight in Plants

接种AMn01时各KSi处理与Cp?的AUDPC无显著差异，但土壤施KSi（KSi?S）略有降低趋势；接种AMn03时KSi?S显著低于Cp?（AUDPC：KSi?S 1.92 vs. Cp? 2.44），KSi?S对AMn03防治效果略高于KSi?F，表明土壤施KSi对减轻豌豆Ascochyta blight更有效。

Effect of Silicon on Growth and Physiological Variables of Pea Plants Inoculated with Didymella Spp.

KSi?S处理相对生长速率（RGR）略高于其他处理（KSi?S 50.75 mm·mm?1·d?1 vs. Cp? 44.79 mm·mm?1·d?1）。接种病原菌植株（Cp?）气孔导度（g_s）最低（136.14 mmol CO?·m?2·s?1），土壤施KSi（213.66 mmol CO?·m?2·s?1）和叶面施KSi（188.48 mmol CO?·m?2·s?1）使g_s恢复至接近健康对照水平（238.85 mmol CO?·m?2·s?1）。SPAD值在AMn01接种后下降，KSi处理使其部分回升（KSi?S 34.71 vs. Cp? 31.36 SPAD），AMn03各处理间SPAD无差异。叶温在AMn03接种各处理略升2~3℃，NPQt在Cp?最低，KSi?S使其回升至Cp?水平，说明Si缓解病原对光合光保护机制的抑制。

四、讨论与结论总结

研究人员指出D. pinodella和D. lethalis首次被确认为哥伦比亚豌豆Ascochyta blight潜在病原，丰富了该地区病原种类认知。体外KSi较CaSi更强抑制Didymella菌丝生长，可能与硅酸盐对真菌细胞的直接毒性或改变培养基pH影响菌丝膨压有关。温室条件下KSi尤其根际施用降低接种后病斑扩展，归因于Si在叶表皮沉积形成物理屏障并诱导PR蛋白及防御酶（PAL、PPO等）表达。Si还缓解了病原侵染导致的气孔部分关闭、叶绿素降解及光系统Ⅱ非光化学淬灭能力下降，促进受侵染植株维持较高光合能力和相对生长。研究表明外源硅尤其是钾硅酸盐（KSi）土壤施用可作为豌豆Ascochyta blight综合管理中的辅助手段，兼具诱导抗性与改善植株生理之效，但需在不同品种及田间条件下进一步验证其稳定性和经济性。

结论（翻译浓缩）：

研究人员从哥伦比亚安第斯山区具典型Ascochyta blight症状的豌豆叶片中分离鉴定出Didymella spp.，其中D. lethalis和D. pinodella为可能的致病因子。硅化合物特别是钾硅酸盐（KSi）在体外抑制Didymella spp.菌丝生长，温室中以KSi土壤浇灌可降低接种豌豆的Ascochyta blight严重度，并促进植株相对生长速率与气孔导度、相对叶绿素含量及非光化学淬灭的恢复。施用Si可作为增强豌豆对Didymella spp.侵染抗性及支持可持续病害管理的农艺措施。