利用肾移植探索衰弱表观遗传标志物

《GeroScience》：Using kidney transplantation to explore epigenetic markers of frailty

　　

衰弱的病因尚不清楚。有假说认为，个体表观遗传机制的差异，特别是DNA甲基化（DNAm），可能有助于解释为何部分个体发生衰弱而其他个体不发生。将表观遗传学指标与个体患者年龄相关性衰弱的转化相联系需要多年纵向研究。为克服这一障碍，本研究在因肾功能衰竭遭受加速衰弱转化的成人队列中，探究了肾移植前后DNAm与衰弱指数（Frailty Index, FI）的关联。虽然移植与衰弱程度降低相关，但衰弱与表观遗传标志物之间缺乏显著关联。

衰弱是一种与年龄相关的临床综合征，其病因尚未明确，给针对性预防和治疗干预的开发带来挑战。大规模流行病学研究已将衰弱与吸烟、低体力活动水平及经济剥夺等外在因素联系起来，提示衰弱并非线性确定性因果链的产物，而是生活方式、环境因素与遗传易感性共同作用下的随机性结局。基于此，表观遗传机制——特别是DNA甲基化（deoxyribonucleic acid methylation, DNAm）的变化——已被作为衰弱的潜在生物标志物加以研究。然而，现有关于DNAm年龄及水平与衰弱关联的研究数量有限，且多为横断面或小样本纵向设计，证据基础亟待扩充。将表观遗传指标与个体患者年龄相关性衰弱的动态转化相联系，通常需要长期随访，这构成了研究的重要瓶颈。

肾功能衰竭（kidney failure, KF）患者为克服这一难题提供了独特模型。尽管衰弱与 chronological age（时序年龄）密切相关，KF患者却在更年轻年龄段即出现衰弱，表现为功能状态差、耐力低下、情绪低落、肌力减弱及体重下降等特征。更为关键的是，肾移植（kidney transplantation, KT）可使多数受者衰弱指标显著改善，从而模拟了衰弱的加速逆转过程。基于此，研究人员开展纵向研究，旨在探索KF患者及其移植受者队列中DNAm与衰弱的关系。

研究纳入昆士兰公主亚历山德拉医院肾脏移植服务部40岁以上透析依赖性移植候选 wait-listed 患者，分为A组（即将接受移植者）和B组（未来六个月内不太可能移植者）。基线数据于尸体供肾移植入院时、活体供肾移植前一周或B组招募时收集，随访期为6个月。衰弱评估采用58项衰弱指数（Frailty Index, FI），该指数按标准化标准构建，已在慢性肾脏病及移植候选者中验证，计算方式为现存健康缺陷数与考虑的总健康缺陷数之比，取值范围为0至1，适用于纵向研究。

表观遗传分析采用血液来源DNA，利用Illumina EPIC甲基化芯片（v2.0）获取全基因组DNAm图谱，覆盖超过850,000个CpG位点。质量控制与数据标准化通过meffil R包（v1.3.8）完成。研究人员采用既定方法从甲基化数据中解析血细胞类型比例（cell type proportions, CTPs）、推断吸烟状态及甲基化年龄等相关指标，并将这些变量作为协变量纳入下游分析。全基因组遗传数据经Illumina Global Screening Array（v3.0）生成，以推断遗传祖先（以顶部遗传主成分表示）和亲缘关系。线性混合模型分析通过OSCA软件（v1.20）实施，检验以下关联：（1）基线DNAm与基线FI；（2）随访DNAm与随访FI；（3）基线DNAm与随访FI。同时以 chronological age 作为对照表型进行平行分析。研究人员还开展了表观基因组关联研究（epigenome-wide association studies, EWAS），在单个DNAm探针水平探索与FI（及 chronological age）的甲基化关联。

研究结果显示：基线共评估41例参与者（A组22例，B组19例），随访31例（A组15例，B组16例）。基线队列平均年龄57.2岁，男性占65.9%。两组基线FI均值均为0.22；A组随访FI均值为0.20，B组为0.25。移植与随访时FI降低相关（β系数=-0.05，95%置信区间0.004–0.087，p=0.03，校正基线FI、年龄和性别后）。

在6,309,002个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）和924,886个DNAm探针数据中，线性混合模型分析未显示FI与基线或随访DNAm存在关联证据，基线DNAm与随访FI亦无关联，无论是否校正协变量。类似地， chronological age 与基线DNAm之间亦未观察到关联。EWAS分析中，经Bonferroni校正后（p_EWAS<1.08×10^-7），未发现有单个CpG探针与基线或随访FI显著相关；但鉴定出18个具有提示性意义的探针（p_EWAS<1×10^-5）。

研究人员在讨论部分对阴性结果进行了审慎分析。首先，研究结果与既往报告的DNAm与FI横断面关联存在分歧，这可能反映表观遗传数据分析方法的差异。Breitling等和Seligman等的研究均考察了DNAm年龄加速（DNAm age acceleration），并在社区老年人群中显示与FI的关联；但Seligman等同样未发现基线DNAm与随访FI的关联，与本研究一致。其次，6个月的随访期可能不足以捕捉显著变化，Seligman等18个月的随访也曾被认为可能不足。第三，有限的样本量可能是未能检出显著关联的重要原因：点估计的方差范围宽泛（0至1，标准误较大）；事后功效计算表明，即使假设解释的方差高达0.8，现有样本的统计功效亦低于80%（α=0.05）；若假设DNAm与≥10%的FI方差相关，则需要近10倍大的样本量才能达到≥80%统计功效。作为佐证，已知与DNAm强关联的 chronological age 在本分析纵床中也呈现弱且不稳定的效应估计，进一步提示样本量不足。

此外，研究人员提出疾病相关（KF相关）衰弱与年龄相关衰弱的表观遗传变化可能存在本质差异。现有证据显示表观遗传学与急性肾损伤和糖尿病肾病的病理发生密切相关，而表观遗传机制在实体器官移植免疫应答中也发挥基础性作用。然而，移植及移植后免疫抑制药物与表观遗传修饰的关系尚不明确。尽管FI包含药物计数（药物越多对应缺陷越多），但未区分基线和随访时的药物类型，故随访期间药物变化可能影响DNAm变化分析。

讨论深入比较了疾病相关与年龄相关衰弱的病理生理差异。慢性低度炎症在衰老和KF人群均与衰弱相关，但驱动因素不同：年龄相关炎症由免疫、激素和代谢变化驱动；KF相关炎症则源于细胞因子清除障碍、透析及尿毒症毒素等炎症刺激物暴露，加上进行性酸中毒、体力活动不足和饮食限制共同导致肌肉蛋白稳态受损，促进肌少症发生。尽管通路存在重叠，但两者在可逆性管理方面存在根本差异，颇具临床意义。

临床层面，虽然疾病相关与年龄相关人群的衰弱评分可能相似，但"衰弱构成"似乎不同。Angioni等发现衰老归因与新发/加重疾病归因衰弱患者在合并症负担、衰弱转化速度及营养状态方面存在显著差异，这对不同人群的衰弱测量具有启示意义。未来研究应纳入无肾脏疾病的老年衰弱成人作为对照，以阐明KF相关与年龄相关衰弱的临床和病理生理特征，这亦是该研究团队当前的工作重点。

肾移植后衰弱改善的结果与近期系统综述一致：KT人群纵向研究一致报告移植后6–12个月衰弱改善。尽管既往KT研究未采用FI，但本研究中FI变化0.05（对应58个变量中约3个更少缺陷）具有临床相关性：Theou等证实FI变化仅0.03对老年住院患者即具临床意义。Varughese等发现FI每增加0.01（对应不足一个缺陷）即可使实体器官移植候选者的死亡（移植前后）或除名风险增加3%。未来纵向研究将有助于在更广泛的等待名单和移植结局中验证基线FI的预测效度。

研究结论：本研究在KF患者中模拟了有/无移植条件下的加速衰弱转化，但未能证实DNAm变化构成这些转化的基础。该研究为未来探索表观遗传变化以及疾病相关与年龄相关衰弱的其他病理生理通路奠定了重要基础。