《Aging Cell》：Aging-Related Muscle Bmal1 Decline Contributes to Bone Loss in Mice via Enhancing IL-1α–Mediated Osteoclastogenesis
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摘要：骨质疏松症是与衰老相关的常见代谢性骨病，常伴发肌肉退变。小鼠骨骼肌Bmal1缺失可影响肾、肺及骨等多组织，提示肌源性分子钟可能通过体循环调控多器官生理稳态，但肌钟在年龄相关性骨质疏松中的作用尚不清楚。研究人员在老年小鼠中观察到肌-骨昼夜节律互作紊乱，肌纤
摘要：骨质疏松症是与衰老相关的常见代谢性骨病，常伴发肌肉退变。小鼠骨骼肌Bmal1缺失可影响肾、肺及骨等多组织，提示肌源性分子钟可能通过体循环调控多器官生理稳态，但肌钟在年龄相关性骨质疏松中的作用尚不清楚。研究人员在老年小鼠中观察到肌-骨昼夜节律互作紊乱，肌纤维内Bmal1表达及肌组织总BMAL1蛋白水平均显著下降。构建骨骼肌特异性Bmal1敲除(Bmal1fl/fl; CKMM-Cre, mKO)小鼠后，出现骨量降低、骨小梁微结构破坏及炎性因子昼夜表达紊乱等骨质疏松表型。机制上，肌Bmal1缺失损害抗氧化基因Hmox1的节律性表达并上调肌细胞内IL-1α(白细胞介素-1α)，升高的循环IL-1α促进破骨细胞分化，最终导致骨量丢失。重要的是，夜间限时进食(Time-Restricted Feeding, TRF)可减轻由肌Bmal1敲除或自然衰老所致的骨质疏松表型——TRF重建了肌组织中摄食驱动的Hmox1昼夜节律变化并降低血清IL-1α水平。本研究揭示了老年人群骨质疏松发病的新机制，并提示TRF可作为治疗老年性骨质疏松的潜在非药物干预策略。
《Aging Cell》刊登的此项研究聚焦骨骼肌分子钟核心基因Bmal1(脑和肌肉芳香烃受体核转位样蛋白1, Brain and Muscle ARNT-like Protein 1, Arntl)的年龄依赖性下调如何通过肌-骨内分泌偶联促进老年性骨质疏松，并探索限时进食(Time-Restricted Feeding, TRF)的干预价值。
目前已知生物钟紊乱与衰老密切相关，Bmal1全身敲除小鼠呈现早衰表型；骨质疏松源于破骨细胞性骨吸收超过成骨细胞性骨形成，且流行病学提示昼夜节律紊乱者骨折风险升高；骨骼肌作为最大内分泌器官可通过"肌肉因子(myokines)"调控骨代谢，但肌组织特异性生物钟尤其是Bmal1在年龄相关性骨丢失中的作用及下游肌肉因子尚未阐明。研究人员假设肌Bmal1衰减是驱动老年性骨质疏松的肌源性因素，通过青年(2月龄)与老年(18月龄)C57BL/6小鼠肌-骨组织时间序列转录组比对、骨骼肌特异性Bmal1敲除(Bmal1fl/fl; CKMM-Cre, mKO)小鼠模型、体外肌-骨髓巨噬细胞(Bone Marrow-Derived Macrophages, BMMs)/骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)共培养、腺病毒干扰及Hmox1激活剂(Carnosol)处理、IL-1α中和抗体阻断，以及ZT12–16夜间TRF干预，系统解析"Bmal1↓→Hmox1节律丧失→ROS↑→IL-1α↑→破骨细胞生成↑→骨丢失"轴，并验证TRF对该轴的挽救效应。
主要关键技术方法：
取2月龄(年轻)与18月龄(老龄)C57BL/6J雄性小鼠，于光照-黑暗(LD 12:12)周期下适应后按ZT(Zeitgeber Time, 开灯后小时数)1/5/9/13/17/21取材行腓肠肌与胫骨转录组测序及MetaCycle节律基因分析；利用CKMM-Cre与Bmal1fl/fl杂交获得骨骼肌特异性Bmal1敲除(mKO)小鼠及同窝对照；micro-CT分析股骨远端松质骨参数；股骨切片行Von Kossa、甲苯胺蓝及抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase, TRAP)染色；原代肌细胞与WT-BMMs/BMSCs跨孔(Transwell)共培养诱导破骨/成骨分化并检测标志基因；C2C12成肌管经ADV-shBmal1敲低并行双荧光素酶报告实验验证BMAL1结合Hmox1启动子E-box；小鼠炎症因子芯片及ELISA检测血清/上清IL-1α；DCFH-DA探针检测活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)；部分mKO及17月龄野生小鼠行ZT12–16(夜间4 h)TRF干预8周(老龄)或2周(mKO)后评估骨表型及肌Hmox1、血清IL-1α变化。
研究结果
2.1 Age-Related Remodeling of Muscle-Bone Crosstalk in Mice(小鼠肌-骨互作的老化相关重塑)
通过对青年与老年小鼠肌、骨六个时点RNA-seq及MetaCycle分析，发现老年骨组织获得1711个新节律基因但振幅降低，老年肌组织节律基因总数略减、振幅显著降低，Bmal1在老年肌纤维(单细胞分辨率)及蛋白水平明显下降；CellphoneDB分析显示老年小鼠肌-骨组织间受体-配体互作峰值相位发生偏移(第二峰从ZT13移至ZT17)。结论：衰老伴随肌-骨组织昼夜转录组重编程及肌-骨昼夜偶联信号紊乱，肌Bmal1在老化肌纤维中特异性下调。
2.2 Skeletal Muscle Cell-Specific Bmal1 Knockout Induces Osteopenia in Male Mice(骨骼肌细胞特异性Bmal1敲除诱发雄性小鼠骨质减少)
mKO小鼠腓肠肌BMAL1蛋白选择性缺失，跑轮自发活动周期延长，体脂降低、瘦体重增加，肌纤维横截面积增大且肌生长抑制素(Myostatin, Mstn)下调；micro-CT显示mKO雄鼠股骨干骺端松质骨BMD(骨密度)、BV/TV(骨体积分数)、Tb.N(骨小梁数目)降低，Tb.Sp(骨小梁分离度)增大，皮质骨BMD无改变，10月龄时表型加剧。结论：骨骼肌Bmal1缺失足以模拟增龄性松质骨丢失与微结构退化，且此过程中肌量未减(Mstn下调代偿)，提示骨丢失源于肌源性分泌因子而非肌萎缩。
2.3 Skeletal Muscle Bmal1 Deficiency Promotes Osteoclast Differentiation(骨骼肌Bmal1缺失促进破骨细胞分化)
股骨Von Kossa染色矿化面积减少，TRAP+破骨细胞数增多而甲苯胺蓝染成骨细胞数无差异；mKO原代肌细胞与WT-BMMs共培养使破骨标志基因Trap、Ctsk及蛋白NFATc1(活化T细胞核因子c1, Nuclear Factor of Activated T-cells Cytoplasmic 1)、TRAP、CTSK上调，TRAP+多核破骨细胞数增加；与BMSCs共培养不影响成骨标志(Alp, Runx2, Bglap)及矿化。结论：肌Bmal1缺失通过分泌途径促进破骨细胞生成而非抑制成骨，是骨丢失的直接原因。
2.4 Bmal1 Knockout in Skeletal Muscle Cells Disrupts Rhythmic Expression of Antioxidant-Related Genes(骨骼肌Bmal1敲除扰乱抗氧化相关基因的节律性表达)
mKO肌组织节律基因数减少，核心钟基因振幅降低；差异表达且丧失节律的270个基因富集于ROS相关通路(HIF-1, MAPK等)，其中抗氧化基因Hmox1(血红素加氧酶-1, Heme Oxygenase 1)节律消失且ZT14(小鼠活跃期)表达下调，Nrf2(核因子E2相关因子2, Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)、Cat(过氧化氢酶, Catalase)振幅减小；染色质免疫沉淀数据库及双荧光素酶实验证实BMAL1-CLOCK异二聚体直接结合Hmox1启动子E-box元件激活其转录；C2C12肌管Bmal1敲低使Hmox1、Nrf2 mRNA降低且胞内ROS升高。结论：BMAL1直接转录调控Hmox1维持肌细胞ROS稳态，Bmal1缺失致Hmox1节律/表达下降及ROS蓄积。
2.5 Skeletal Muscle Bmal1 Regulates IL-1α Expression via the Antioxidant Pathway(骨骼肌Bmal1通过抗氧化通路调控IL-1α表达)
mKO血清炎症因子芯片筛选及ELISA确认循环IL-1α显著升高；C2C12肌管Bmal1敲低后上清IL-1α升高(IL-13则降，提示血清IL-13非肌源)；Hmox1激活剂Carnosol恢复mKO肌管HMOX1蛋白、抑制IL-1α上调及ROS累积；原代肌细胞-BMMs共培养中加入抗IL-1α中和抗体可逆转mKO肌细胞引起的破骨标志上调及TRAP+细胞增多。结论：肌Bmal1缺失→Hmox1↓→ROS↑→肌细胞IL-1α释放增多→循环IL-1α促进破骨细胞生成(Hmox1–IL-1α轴)，IL-1α是肌源性促破骨细胞生成的关键介质。
2.6 Time-Restricted Feeding Increases Bone Mass in Skeletal Muscle-Specific Bmal1 Knockout and Aged Mice(限时进食提升骨骼肌特异性Bmal1敲除及老龄小鼠的骨量)
mKO及17月龄小鼠行ZT12–16夜间TRF后，松质骨BMD、BV/TV、Tb.N回升，Tb.Sp减小；TRF驱动mKO及老龄肌组织Hmox1产生摄食诱导的昼夜变化(ZT14高于ZT2)，血清IL-1α水平下降；年轻(5月龄)小鼠TRF对骨参数无影响。结论：夜间TRF可绕开肌内源Bmal1缺陷，通过摄食信号重建肌Hmox1节律、抑制IL-1α、改善增龄性或肌Bmal1缺失所致骨丢失，对年轻成年骨无额外作用。
讨论与结论总结
讨论指出本研究首次揭示肌-骨昼夜偶联在衰老中重塑，肌特异性Bmal1缺失模拟老年性骨质疏松且通过Hmox1–ROS–IL-1α轴促进破骨细胞生成；mKO小鼠因Mstn下调出现肌肥大但仍骨丢失，说明肌分泌炎症状态独立于肌量；TRF作为强效外周钟同步因子可在Bmal1缺陷背景下重新诱导Hmox1节律并降IL-1α，为老年性骨质疏松提供非药物干预依据；研究局限含TRF伴随轻度体重/热量差及未直接用NF-κB抑制剂验证ROS–NF-κB–IL-1α级联。
结论翻译：本研究发现小鼠衰老过程中骨骼肌与骨组织昼夜互作发生重塑。构建的肌特异性Bmal1敲除小鼠表明，Bmal1缺失直接抑制抗氧化基因Hmox1的节律性表达，升高肌细胞内活性氧(ROS)水平并诱导炎性因子IL-1α的表达，最终促进破骨细胞分化导致骨丢失。对Bmal1敲除鼠及老龄鼠实施限时进食(TRF)可驱动肌组织摄食诱导的Hmox1昼夜表达、降低血清IL-1α并缓解骨量丢失。这些发现提示TRF可作为减轻年龄相关性骨丢失的有效非药物干预策略。
