氧化应激与线粒体蛋白稳态储备下降关联老年小鼠肌肉中增强的线粒体未折叠蛋白反应(mtUPR)启动

《Aging Cell》：Oxidative Stress and Diminished Mitochondrial Proteostatic Reserve Are Linked to Enhanced mtUPR Initiation in Aged Mouse Muscle

　　

摘要：线粒体功能障碍、蛋白稳态(proteostasis)受损以及应激抵抗与恢复力(resilience)下降是衰老的标志。位于这些标志核心的是线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response, mtUPR)，这是一种在响应蛋白毒性时恢复线粒体蛋白稳态的转录通路。尽管mtUPR在无脊椎动物和细胞培养模型中已被广泛研究，但mtUPR如何在衰老哺乳动物组织中启动仍不明确。本研究明确了重复性物理应激(physical stress)在多大程度上启动老年小鼠骨骼肌mtUPR转录及体内候选调控机制。与年轻肌肉相比，老年肌肉的线粒保护分子伴侣(chaperone)和蛋白酶(protease)可用性降低，且肌原纤维间线粒体(intermyofibrillar mitochondria, IMF)碳酰化(carbonylation)程度更高，提示蛋白稳态储备(proteostatic reserve)下降及氧化负荷(oxidative burden)增加。短期物理应激诱导老年肌肉比年轻肌肉出现更显著的mtUPR基因启动，这与生理储备降低相吻合。物理应激使ATF5在两种年龄肌肉中均从线粒体转位至细胞核，而CHOP mRNA及核转位仅在老年肌肉中选择性升高。机制上，研究人员证明线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species, mtROS)参与老年骨骼肌mtUPR启动。通过体内染色质免疫沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)及体外敲低/抑制实验，研究人员提供支持证据表明CHOP作为氧化还原敏感因子，部分参与老年小鼠肌肉中增强的mtUPR启动，可能与JNK信号有关。综上，数据提示老年肌肉中线粒体蛋白稳态储备减少及mtROS信号增强共同导致重复物理应激后mtUPR转录反应放大，为探索哺乳动物衰老中mtUPR奠定基础。

论文解读：氧化应激与线粒体蛋白稳态储备下降关联老年小鼠肌肉中增强的线粒体未折叠蛋白反应(mtUPR)启动

本研究发表于《Aging Cell》。线粒体功能障碍与蛋白稳态(proteostasis)受损是衰老的核心特征，线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response, mtUPR)是细胞应对线粒体蛋白毒性、上调线粒保护分子伴侣、蛋白酶、抗氧化酶及导入机器以恢复线粒体蛋白稳态的关键转录通路。在无脊椎动物模型中mtUPR已被充分表征，其在应激后维持线粒体功能并促进健康寿命；然而，mtUPR如何在衰老哺乳动物组织——特别是承重、高耗能的骨骼肌——中被物理应激启动及体内调控机制尚不清楚。已有研究表明年轻啮齿动物骨骼肌在单次急性运动后可出现mtUPR启动，但重复应激下老年哺乳动物的mtUPR响应及其与增龄相关的线粒体氧化还原环境、蛋白稳态储备变化的关系未见报道。鉴于老年机体应激抵抗(resistance)与恢复力(resilience)下降，明确重复物理应激下老年肌肉mtUPR的启动幅度与调控机制对理解衰老相关的线粒体功能衰退至关重要。因此，研究人员以年轻（4～5月龄）与老年（雄性24月龄，雌性22月龄）C57BL/6小鼠为模型，施加连续3日跑台至力竭的重复物理应激范式，综合应用Western blot、qRT-PCR、细胞分馏、免疫荧光碳酰化检测、体内线粒体靶向抗氧化剂(MitoTEMPO)干预、染色质免疫沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)、C2C12成肌管(shRNA敲低)及HEK293T(H₂O₂敏感探针HyPer7)实验，探究老年骨骼肌mtUPR转录启动特征及mtROS、ATF5、CHOP、JNK的调控作用。

主要关键技术方法：

研究人员采用年轻（4～5月龄）与老年（雄性24月龄，雌性22月龄）C57BL/6小鼠，分为静息(SED)组与连续3日跑台至力竭重复物理应激(RUN)组，部分老年雄鼠在跑前给予线粒体靶向抗氧化剂MitoTEMPO或对照。处死6 h后取腓肠肌与趾肌，测定：(1)全肌匀浆及经OXPHOS蛋白标准化的线粒保护分子伴侣(HSP60、mtHSP70、HSP10)与蛋白酶(LONP1、CLPP、YME1L1)含量；(2)亚细胞分馏测定ATF5、ATF4、CHOP的细胞定位；(3)肌原纤维间(IMF)与肌膜下(SSM)线粒体蛋白碳酰化免疫荧光定量；(4)qRT-PCR检测mtUPR靶基因（Hsp60、mtHsp70、Hsp10、Dnaja3、Yme1l1、Lonp1、Clpp、Clpx、Txn2、SOD2、Timm13、Timm17a）及转录因子(Atf5、Atf4、CHOP) mRNA；(5)老年雄鼠RUN±MitoTEMPO干预下mtUPR基因变化及ChIP-qPCR检测CHOP在mtHsp70启动子富集；(6)C2C12成肌管Gamitrinib-TPP(GTPP)诱导线粒体基质蛋白错误折叠±mtROS调节剂(Antimycin A/MitoTEMPO/NAC)或JNK抑制剂(SP600125)及shCHOP敲低后qRT-PCR/Western blot；(7)HEK293T转染线粒体基质或胞质/核定位HyPer7探针动态监测mtROS；磷酸化时间曲线检测JNK/p38 MAPK/eIF2α活化。

研究结果

2.1 Aging Reduces Mitoprotective Chaperone and Protease Stoichiometry in Skeletal Muscle

研究人员测定年轻与老年小鼠骨骼肌全肌匀浆中线粒体分子伴侣与蛋白酶总含量，并以总氧化磷酸化(OXPHOS)蛋白为线粒体质量替代指标计算化学计量比。结果显示老年肌肉中HSP60、mtHSP70、HSP10相对于OXPHOS蛋白的化学计量比均显著低于年轻肌肉；LONP1/OXPHOS比值也随龄下降，YME1L1/OXPHOS比值在老年雌鼠降低。提示衰老使单位线粒体质量所对映的线粒保护蛋白修复能力下降，即线粒体蛋白稳态储备(proteostatic reserve)缩减。

2.2 Reduced Physiological Reserve in Aged Mice Coincides With Heightened mtUPR Transcriptional Initiation Following Repeated Physical Stress

跑台测试显示老年鼠各次奔跑至力竭距离均短于年轻鼠，年轻鼠在第2、3次距离较第1次缩短，符合重复应激下生理储备耗减。qRT-PCR显示年轻肌肉经重复应激仅少数mtUPR靶基因上调，而老年雌鼠6/12个基因显著上调、老年雄鼠9/12个基因显著上调；Z-score聚合复合诱导评分显示老年肌肉mtUPR转录启动幅度显著强于年轻。单次急性跑后同样观察到老年mtUPR诱导更强。表明重复物理应激在老年骨骼肌引发更显著的mtUPR转录程序启动，与缩减的生理储备相符。

2.3 Repeated Physical Stress Alters ATF5 Subcellular Localization and Regulates CHOP in an Age-Dependent Manner

重复应激使年轻与老年肌肉中ATF5从线粒体向细胞核转位增加（老年静息态核转位已高于年轻）。Atf5与Atf4 mRNA不因应激改变，但CHOP mRNA仅在老年应激肌肉显著升高，总CHOP与ATF4蛋白在老年肌肉基础水平升高。核质分馏显示ATF4定位不受应激影响，CHOP核质比在老年雄鼠应激后显著升高（雌鼠无此变化）。提示ATF5为两年龄共有mtUPR核心调节因子，CHOP转录激活及核转位增强为老年特异现象。

2.4 Aged Intermyofibrillar Mitochondria Exhibit Elevated Protein Carbonylation

免疫荧光定量显示仅肌原纤维间线粒体(IMF)蛋白碳酰化水平随龄显著升高，肌膜下(SSM)线粒体无变化，重复跑台未进一步升高。IMF线粒体直接供能收缩活动，其选择性碳酰化升高提示老年IMF线粒体存在慢性氧化损伤与潜在mtROS升高背景，为mtUPR增强启动提供氧化还原信号线索。

2.5 Mitochondrial Redox Signaling Contributes to mtUPR Initiation in Myotubes and Aged Muscle

C2C12成肌管中GTPP诱导线粒体基质蛋白错误折叠单独可启动mtUPR（Hsp60、mtHsp70上调），添加Antimycin A进一步增强、MitoTEMPO（线粒体靶向超氧化物歧化酶模拟物）部分抑制该上调，非线粒体靶向NAC作用微弱；且GTPP本身在HEK293T中快速引起线粒体基质H₂O₂升高。活体实验中，老年雄鼠给予MitoTEMPO后重复跑诱导的多数mtUPR靶基因上调被显著削弱（跑量不受影响）。证实mtROS协同线粒体蛋白毒性放大mtUPR转录启动，且在老年肌肉体内mtROS参与应激诱导mtUPR启动。

2.6 CHOP Contributes to the Redox-Sensitive Initiation of the Muscle mtUPR

老年鼠肌肉ChIP-qPCR显示CHOP富集于mtHsp70启动子，重复跑增加其占据，MitoTEMPO减弱之。C2C12成肌管shRNA敲低CHOP部分减弱GTPP引起的Hsp60与mtHsp70上调。表明CHOP作为氧化还原敏感转录因子结合mtUPR基因启动子，参与（尤其老年）肌肉mtUPR启动。

2.7 JNK Is Hyperphosphorylated in Aged Muscle Following Physical Stress and Contributes to Redox-Sensitive mtUPR Initiation in Myotubes

单次及重复跑后老年雄鼠腓肠肌JNK磷酸化(p-JNK)即刻显著升高而年轻不升，p38 MAPK与eIF2α磷酸化无变化。C2C12中GTPP引起JNK磷酸化，JNK抑制剂SP600125削弱GTPP诱导的CHOP、Hsp60、mtHsp70 mRNA上调；MitoTEMPO取消GTPP引起的JNK磷酸化，SP600125部分减少GTPP引起的mtROS生成。提示JNK是mtROS下游节点，活化后促进CHOP转录及进一步mtROS生成，形成正反馈，放大老年肌肉mtUPR启动。

讨论与结论翻译

重复物理应激在老年相对于年轻骨骼肌引发更显著的mtUPR转录程序启动。该增龄增强反应与线粒保护分子伴侣/蛋白酶相对含量降低（暗示线粒体蛋白稳态储备缩减）及肌原纤维间(IMF)线粒体选择性蛋白碳酰化升高（暗示氧化负荷增加）共存。机制上，mtROS参与老年肌肉应激诱导mtUPR启动；体外实验显示mtROS需在存在线粒体蛋白毒性背景下放大mtUPR转录而非单独驱动。体内ChIP-qPCR与体外敲低支持CHOP作为氧化还原敏感因子部分贡献物理应激后mtUPR基因诱导，尤见于老年肌肉。物理应激后CHOP转录增强关联老年肌肉JNK超磷酸化，成肌管实验将JNK置于mtROS下游调控CHOP及mtUPR转录，且JNK与mtROS互促。综上，老年哺乳动物肌肉中线粒体蛋白稳态储备降低与mtROS信号增强共同促成重复物理应激后mtUPR转录反应放大。ATF5可能为两年龄共有核心mtUPR调节因子，CHOP则在老年作为额外氧化还原敏感调节臂调制mtUPR幅度。本研究为在哺乳动物衰老背景下探索mtUPR功能奠定机制基础。