副干酪乳杆菌L9通过肠-肺轴介导的免疫细胞迁移调控改善老龄小鼠肺纤维化

《Aging Cell》：Lactobacillus paracasei L9 Ameliorates Pulmonary Fibrosis in Aged Mice via Gut-Lung Axis-Mediated Regulation of Immune Cell Migration

　　

年龄相关性肺纤维化（PF）正造成日益加重的全球疾病负担，而现有治疗手段有限。本研究探讨了副干酪乳杆菌L9（L9）在缓解C57BL/6J小鼠肺纤维化中的作用及其机制。连续9个月口服给予L9（4 × 10⁹ CFU/mL）可抑制老龄小鼠肺内胶原蛋白I型（Col-I）沉积，而对胶原蛋白III型（Col-III）无显著影响。在机制上，L9抑制c-Jun N末端激酶-热休克转录因子1（JNK-HSF1）信号通路，从而使对Col-I合成至关重要的热休克蛋白47（HSP47）表达降低61%。L9通过增加短链脂肪酸（SCFA）产生菌（如Blautia）重塑肠道菌群，导致血清丙酸升高97%、丁酸升高193%；值得注意的是，肺组织中SCFA水平低于检测下限。在L9处理小鼠中，肺内白细胞介素-17A（IL-17A）水平及Th17细胞群体均降低。体外实验表明，SCFA可直接抑制Th17细胞分化和IL-17A分泌，并证实IL-17A可在肺成纤维细胞中通过JNK-HSF1通路促进Col-I合成。因此，L9可通过调节肠道菌群产生SCFA，并经由肠-肺轴调控初始CD4⁺ T细胞分化与迁移，减少肺内Th17细胞及IL-17A，进而抑制肺成纤维细胞Col-I合成，最终缓解年龄相关性PF。综上，本研究强调L9可作为一种以微生物组为靶点的精准营养策略，通过新型肠-肺轴机制用于年龄相关性PF的辅助治疗。

该文发表于《Aging Cell》，聚焦老龄相关性肺纤维化（PF）的营养干预新策略。肺纤维化是一类随年龄增长而显著增多的慢性进行性肺部疾病，其核心病理基础在于肺泡上皮反复损伤后，肌成纤维细胞异常活化并持续分泌细胞外基质（ECM），最终造成肺结构重塑、肺实质僵硬和呼吸功能下降。老龄肺组织在胶原合成与降解稳态维持方面能力减弱，尤其更易发生胶原沉积失衡，因此年龄增长被视为PF发生的重要推动因素。现阶段PF药物治疗选择有限，且存在成本高和不良反应等问题，因此寻找副作用较低、可长期干预的策略具有重要现实意义。近年来，肠道菌群及其代谢物可通过肠-肺轴（gut-lung axis）调节肺部炎症与免疫反应的观点逐渐受到重视。副干酪乳杆菌L9来源于健康长寿老人肠道，既往研究提示其具有调节呼吸道免疫反应的潜力，但其是否能够改善老龄相关性PF及其作用机制仍缺乏直接证据。因此，研究人员围绕“L9是否通过肠-肺轴改善老龄肺纤维化”这一问题开展了系统研究。

在研究方法上，研究人员首先结合公开转录组数据库分析人和小鼠老龄肺组织的纤维化相关分子变化，并采用人肺旁癌组织样本进行验证。随后以自然衰老C57BL/6J小鼠为模型，进行为期9个月的L9灌胃干预，通过HE染色、Masson染色、天狼星红染色、Western blot、免疫荧光和ELISA评估肺纤维化、胶原代谢及炎症状态；以16S rRNA测序和气相色谱-质谱联用（GC-MS）/液相质谱检测分析肠道菌群和SCFA变化；进一步分离初始CD4⁺ T细胞诱导Th17分化，并在NIH/3T3成纤维细胞中结合siRNA干预验证IL-17RA-JNK-HSF1-HSP47轴。人群样本来源于8例肺癌患者的肺旁癌组织，按年龄分为青年组与老年组。

研究结果部分显示，论文首先从老龄肺组织本身出发，证明衰老与纤维化表型之间具有明确关联。

在“2.1 PF Markers Are Increased in the Lung Tissue of Aging Individuals”部分，研究人员利用GEO数据库的人肺组织转录组数据发现，老年组存在大量差异表达基因，其中与ECM结构组成相关的基因显著上调，疾病关联富集分析也提示纤维化风险升高。对人肺组织样本的进一步验证表明，老年组Col-I、Col-III和α-SMA蛋白表达均显著升高，病理染色可见肺实质增厚、气道重塑以及明显胶原沉积，提示健康衰老肺组织已表现出纤维化倾向。

在“2.2 PF Markers Are Increased in the Lung Tissue of Aging Mice, With Collagen Deposition Being the Main Contributing Factor”部分，研究人员在老龄小鼠肺组织中获得与人群一致的结果。公开数据库分析显示老龄鼠肺组织中ECM相关基因显著上调，且纤维化风险增加。实验检测进一步证实Col-I、Col-III及α-SMA蛋白表达升高，病理学上可见肺泡结构受损、肺密度增加和明显胶原沉积。基于这些结果，研究人员认为胶原沉积是老龄小鼠PF表型的主要贡献因素。

在“2.3 L9 Alleviates Fibrosis Through Col-I Deposition in Aging Mice, Rather Than Col-III”部分，研究人员通过自然衰老小鼠长期口服L9干预发现，L9并不影响体重稳定，但可明显减轻肺组织炎症损伤和结构破坏，降低Ashcroft纤维化评分，并显著减少胶原纤维沉积。天狼星红染色提示Col-I/Col-III比值下降，Western blot进一步显示L9使Col-I总量下降59%，而Col-III无显著改变，同时α-SMA、p21和p16表达也显著下调。这说明L9对老龄PF的改善主要表现为特异性抑制Col-I沉积，并伴随纤维化和细胞衰老标志缓解。

在“2.4 L9 Reduces the Amount of Col-I via Inhibiting Its Synthesis”部分，研究人员进一步区分L9对Col-I合成、交联与降解的影响。结果显示，Col-I合成关键前体指标PINP在L9组下降61%，提示其对合成过程抑制显著。交联相关酶中，LOXL2变化不明显，而LOX表达下降，并且免疫荧光证实气道周围LOX减少。相比之下，Cathepsin K、MMP1和MMP2虽有下降趋势，但无统计学意义。因此，L9降低Col-I的主要方式不是增强降解，而是抑制其合成过程。

在“2.5 L9 Inhibits the Expression of Molecular Chaperone HSP47 and Thus Suppresses Its Synthesis”部分，研究人员沿着胶原前体合成通路向前追踪，发现L9对丝氨酸/脯氨酸合成相关酶P5CS、PSAT-1和PHGDH无显著影响，对Col1α1、Col1α2及C端前肽相关蛋白虽有下降趋势但未达显著性。真正显著受抑制的是胶原折叠分子伴侣HSP47，其表达下降61%。免疫荧光共定位显示，表达HSP47的α-SMA阳性成纤维细胞数量下降88%。这表明L9主要通过抑制HSP47介导的Col-I正确折叠与成熟而抑制胶原生物合成。

在“2.6 L9 Regulates HSP47 Expression Through the IL-17RA-Mediated JNK-HSF1 Pathway”部分，研究人员继续向HSP47上游追溯。HSP47编码基因SERPIN H1转录水平在L9组显著下降，提示转录调控受影响。其关键转录因子热休克转录因子1（HSF1）及JNK磷酸化水平均明显降低，MKK4和MKK7表达也减少，说明JNK-HSF1轴受到抑制。进一步分析上游调控网络发现，ASK1、TAK1和HPK1亦显著下降。与此同时，IL-17RA、IL-6R、IL-1R-I和TGFβR2表达均受抑制，其中IL-17RA变化最为显著。该结果提示L9可能是通过抑制炎性细胞因子受体介导的JNK信号传导，进而下调HSP47与Col-I合成。

在“2.7 L9 Reduced the Number of Th17 Cells in the Lungs and the Level of IL-17”部分，研究人员进一步检测上述受体对应配体，发现L9干预后肺组织IL-17A、IL-6、IL-1β和TGFβ1均明显下降，其中IL-17A下降最具代表性。免疫荧光显示，与α-SMA共定位的IL-17RA阳性成纤维细胞显著减少，说明IL-17A/IL-17RA可能是连接免疫改变与成纤维细胞促纤维化反应的关键节点。

在“2.8 L9 Increased the Abundance of SCFA-Producing Bacteria in the Intestines of Aging Mice”部分，研究人员转向肠道层面。16S rRNA测序显示，L9并未显著改变α多样性，但显著重塑肠道菌群结构。属水平分析发现，L9降低了部分潜在有害菌，如Acinetobacter和Desulfovibrio，并提高Dubosiella、Lactobacillus以及Blautia、norank_f__Lachnospiraceae、Colidextribacter、Lachnospiraceae_UCG-006、Rikenella等SCFA相关菌群丰度。靶向代谢组学分析显示，粪便中多种SCFA升高，其中丙酸和丁酸分别增加74%和64%。该结果说明L9能够促进老龄肠道中SCFA产生菌富集，并增强SCFA生成能力。

在“2.9 L9 Increased the Levels of Propionic Acid and Butyric Acid in the Gut and Serum of Aging Mice”部分，研究人员进一步证实升高的丙酸和丁酸进入循环系统，血清中丁酸和丙酸分别升高193%和97%。然而肺组织内两者均低于检测下限，提示SCFA并非通过在肺内局部积累发挥作用。相关性分析显示，血清丙酸和丁酸升高与PF改善呈正相关，且丁酸关联更强。进一步检测发现，L9干预后肺组织Th17细胞数量下降71%，循环IL-17A下降33%。因此，研究人员提出SCFA更可能通过调节外周免疫细胞，间接影响肺内炎症与纤维化过程。

在“2.10 Propionic Acid and Butyric Acid Suppress Th17 Cell Differentiation, Thereby Alleviating PF”部分，体外实验为上述推论提供了直接证据。研究人员分离初始CD4⁺ T细胞，并在IL-6、IL-1β和TGFβ1存在下诱导Th17分化。结果显示，丙酸和丁酸分别使IL-17A生成下降46%和81%，并均抑制Th17分化，且丁酸抑制作用更强。随后在NIH/3T3成纤维细胞中直接补充IL-17A，发现其能够促进Col-I合成。进一步通过siRNA沉默IL-17RA后，IL-17A诱导的ASK1、MKK7、MKK4、p-JNK、HSF1、HSP47及Col-I上调均被显著逆转；而共同沉默JNK1/JNK2后，上游IL-17RA及ASK1-MKK4/7仍维持高表达，但下游HSF1、HSP47和Col-I被显著抑制。这一结果从因果层面证明了IL-17RA-JNK-HSF1-HSP47轴是驱动成纤维细胞Col-I生成的关键通路。

讨论部分总结认为，本研究建立了一个较为完整的肠-肺轴抗纤维化机制链条：L9重塑肠道菌群，提高SCFA产生菌丰度，增加丙酸和丁酸进入血液循环；循环SCFA抑制初始CD4⁺ T细胞向Th17分化，并减少Th17细胞向肺组织迁移，最终降低肺内IL-17A水平；IL-17A下降后，肺成纤维细胞表面IL-17RA受体及其下游ASK1-MKK4/7-JNK-HSF1信号被抑制，HSP47表达降低，Col-I合成减少，从而减轻肺ECM沉积和老龄相关性PF。文章同时强调，L9对Col-I而非Col-III的选择性调控提示其具有较高干预精度，即主要削弱与病理性组织僵硬相关的胶原I型沉积，而并未广泛破坏维持基本组织稳态所需的胶原III型网络，这一点对于理解其潜在安全性和靶向性具有重要意义。

研究结论部分可概括翻译为：研究人员证实，副干酪乳杆菌L9能够通过肠-肺轴机制缓解老龄相关性肺纤维化。其核心作用路径为重塑肠道菌群、提升丙酸和丁酸生成、抑制Th17细胞分化及肺部募集、降低IL-17A信号，并进一步抑制肺成纤维细胞中IL-17RA介导的JNK-HSF1-HSP47通路，从而减少Col-I合成与沉积。该研究表明，L9有望作为一种以微生物组为靶点的精准营养辅助干预策略，为老龄相关性肺纤维化的防治提供新的理论依据和潜在应用方向。