生酮饮食和β-羟基丁酸抑制膀胱癌生长并增强抗PD-L1免疫治疗效果

《Cancer Science》：Ketogenic Diet and β-Hydroxybutyrate Suppress Bladder Cancer Growth and Enhance Anti-PD-L1 Immunotherapy Efficacy

　　

免疫检查点抑制剂（ICIs）在膀胱癌（BCa）治疗中的临床疗效有限，仍是一个主要挑战。在此，研究人员报告生酮饮食（KD）及其主要循环代谢物β-羟基丁酸（β-HB）抑制膀胱肿瘤生长并增强对PD-L1抑制剂的反应。在同源MB49模型中，与正常饮食（ND）相比，KD减少了肿瘤生长。KD增加了血浆β-HB，并与更高的瘤内PD-L1表达相关。在ND下补充外源性β-HB重现了KD的抗肿瘤效应，进一步增强了抗PD-L1疗效。机制上，β-HB增加了膀胱癌细胞内的活性氧（ROS）并破坏了线粒体膜电位，导致ATP耗竭和凋亡增强。此外，β-HB还通过GPR109A-JAK2-STAT3信号轴在体外和体内上调PD-L1。对处理过的肿瘤进行免疫分析显示，CD8⁺ T细胞和自然杀伤细胞（NK cells）的浸润和效应功能增加，免疫抑制性群体减少，这些变化在与抗PD-L1联合时进一步放大。总之，研究人员的结果表明，KD和β-HB发挥肿瘤内在和免疫调节效应，使膀胱肿瘤对PD-L1抑制剂（PD-L1 inhibitor）敏感，支持进一步评估生酮干预作为BCa免疫治疗（immunotherapy）的辅助手段。

**研究背景**
膀胱癌（bladder cancer, BCa）是全球第十大常见癌症，每年约57.3万新发病例，男性发病率约为女性的四倍。尽管约75%的BCa患者肿瘤局限于黏膜或黏膜下层，但多数患者出现复发或远处转移，生存率下降。对于肌层浸润性BCa及转移性病例，铂类联合化疗是传统标准方案；近年来，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）如靶向程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）的阿替利珠单抗被批准用于治疗晚期BCa，但仅部分患者获益，且存在原发性和获得性耐药问题。因此，提高ICIs疗效并克服耐药是当前BCa治疗的重要挑战。代谢干预策略，如热量限制和碳水化合物限制的生酮饮食（ketogenic diet, KD），可通过限制葡萄糖利用干扰癌细胞依赖的糖酵解（Warburg效应），在多种肿瘤模型中显示抗肿瘤潜力。已有研究表明KD可抑制肾癌和黑色素瘤生长并增强ICIs效果，但其在BCa中的作用尚未明确。

**研究内容与结论**
研究人员通过体内外实验系统探究了KD及其主要循环代谢物β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate, β-HB）在BCa中的抗肿瘤作用及免疫调节机制。在C57BL/6J小鼠的MB49同源移植瘤模型中，KD显著抑制肿瘤生长，增加血浆β-HB水平，并升高瘤内PD-L1表达。在免疫缺陷BALB/c裸鼠模型中，KD仍抑制肿瘤生长，提示其具有不依赖适应性免疫的直接抗肿瘤效应。体外实验中，β-HB处理（10 mM）显著降低人源（T24、5637）和小鼠源（MB49）BCa细胞活力、增殖、迁移和侵袭能力。机制层面，β-HB升高细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS），破坏线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, ΔΨm），导致ATP耗竭并激活caspase-3依赖性凋亡。RNA测序（RNA-seq）和Western blot分析表明，β-HB通过GPR109A受体激活JAK2-STAT3信号轴，进而上调PD-L1 mRNA和蛋白表达。在生理相关浓度（1.5 mM）下，β-HB同样抑制细胞生长并激活JAK2-STAT3通路，且该效应可被GPR109A拮抗剂溴美喷酯（mepenzolate bromide）阻断。进一步体内联合治疗实验中，KD或外源性β-HB腹腔注射（β-HB_i.p.）均增强抗PD-L1抗体疗效，表现为肿瘤体积和重量显著减小。流式细胞术分析显示，β-HB处理重塑肿瘤微环境：增加CD8⁺ T细胞和自然杀伤细胞（NK cells）的浸润比例及效应功能（IFN-γ⁺、TNF-α⁺），同时减少髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）、调节性T细胞（Treg cells）等免疫抑制性群体；联合抗PD-L1进一步放大这些变化。

**重要意义**
该研究首次在BCa模型中证明KD及β-HB可通过肿瘤内在机制（ROS-线粒体功能障碍-凋亡）和免疫调节机制（上调PD-L1、重塑肿瘤微环境）发挥抗肿瘤作用，并增强PD-L1阻断疗效。论文发表在《Cancer Science》。这些发现为KD或controlled β-HB supplementation作为ICIs辅助治疗策略提供了理论基础，支持进一步的转化研究。

**主要关键技术方法**（不超过250字）
研究人员从Procell Life Technology（人源T24、5637）和上海中乔新舟生物技术（鼠源MB49）获得细胞系，并从Charles River Laboratories获取6周龄雌性C57BL/6J和BALB/c裸鼠。通过皮下注射MB49细胞建立同源移植瘤模型，实施KD或正常饮食（normal diet, ND）干预及β-HB腹腔注射。采用RNA-seq（上海生物技术公司）、流式细胞术（分析肿瘤浸润淋巴细胞亚群及细胞内细胞因子）、Western blot、免疫组化（IHC）和TUNEL染色、ROS和线粒体膜电位检测（荧光显微镜）、细胞活力（CCK-8）及集落形成、EdU掺入、划痕愈合和Transwell侵袭实验等。关键抑制剂包括AG490（JAK2-STAT3抑制剂）和溴美喷酯（GPR109A拮抗剂）。

**研究结果**
3.1 Ketogenic Diet Inhibits Bladder Tumor Growth and Raises Circulating Level of β-HB In Vivo：在C57BL/6J小鼠MB49模型中，KD组肿瘤体积和重量显著低于ND组，血浆β-HB升高，肿瘤中Ki-67降低、TUNEL阳性增加；在BALB/c裸鼠中KD亦抑制肿瘤生长，证明适应性免疫非依赖的直接抗肿瘤作用。
3.2 β-HB Inhibits Bladder Cancer Cell Activity, Proliferation, Migration and Invasion In Vitro：β-HB（10 mM）处理24 h降低T24、5637、MB49细胞活力，抑制集落形成、EdU掺入（DNA合成）、划痕愈合和Transwell侵袭。
3.3 β-HB Promotes Apoptosis in Bladder Cancer Cells by Increasing Their Reactive Oxygen Species Levels：β-HB升高细胞内ROS，降低线粒体膜电位（TMRE荧光减少），减少ATP水平，激活caspase-3，并增加Annexin V-FITC/PI阳性凋亡细胞比例，呈浓度依赖性。
3.4 β-HB Regulates Immune Pathways in Bladder Cancer Cells：RNA-seq显示β-HB处理5637细胞后，细胞周期相关基因集（E2F靶点、G2M检查点）下调，免疫相关通路（IL6-JAK-STAT3、IL2-STAT5、TNF-α、TGF-β）显著富集。
3.5 β-HB Upregulates PD-L1 in Bladder Cancer Cells：β-HB以浓度梯度相关性增加PD-L1 mRNA和蛋白表达，免疫荧光显示膜表面PD-L1增强；KD组小鼠肿瘤中PD-L1 IHC染色增强。JAK2和STAT3磷酸化水平升高，AG490抑制β-HB诱导的PD-L1上调，证实JAK2-STAT3通路介导。
3.6 β-HB Exerts Anti-Tumor Effects and Activates JAK2-STAT3 Signaling at KD-Induced Concentration In Vitro：在1.5 mM β-HB（模拟体内KD血浆浓度）下，细胞活力和DNA合成受抑制，但ROS和线粒体损伤不明显；JAK2-STAT3磷酸化及STAT3核转位仍被诱导，且被GPR109A拮抗剂溴美喷酯减弱，提示GPR109A是该信号的上游受体。
3.7 Ketogenic Diet and β-HB Remodel the Tumor Microenvironment and Enhance the Efficacy of ICIs in Bladder Cancer：KD或β-HB_i.p.联合抗PD-L1较单一治疗显著抑制肿瘤生长。流式分析显示β-HB_i.p.增加瘤内CD8⁺ T细胞和NK细胞比例及IFN-γ⁺、TNF-α⁺比例，减少MDSCs、成熟树突状细胞（DCs）和Treg细胞；联合抗PD-L1进一步放大这些变化，ELISA证实IFN-γ和TNF-α水平升高。

**总结讨论部分**
KD作为癌症辅助策略受到关注，已有临床前研究证实其在胶质瘤、乳腺癌中的抗肿瘤作用，临床研究提示KD联合化疗可提高生活质量并降低循环肿瘤标志物。本研究首次在BCa同源模型中证明KD具有显著抑瘤效果，且在免疫缺陷小鼠中仍有效，强调β-HB对肿瘤细胞的直接作用。β-HB通过ROS介导的线粒体功能障碍和能量耗竭诱导凋亡，同时通过GPR109A-JAK2-STAT3轴上调PD-L1表达。尽管体外使用10 mM β-HB高于体内1.5 mM的循环水平，但1.5 mM浓度下仍观察到细胞生长抑制和JAK2-STAT3激活，且GPR109A拮抗剂可阻断该效应，表明这些信号事件在生理浓度下即可发生。膀胱作为空腔脏器适合局部给药，膀胱内灌注β-HB可能达到更高局部浓度，为未来探索提供了理论依据。PD-L1上调在临床上既是免疫逃逸的介质，也是改善ICIs疗效的潜在标志；本研究中KD/β-HB上调PD-L1并重塑免疫微环境（增加效应细胞、减少抑制性群体），从而增强抗PD-L1疗效。研究局限性包括：需在患者来源样本中验证、需阐明GPR109A至JAK2的具体信号机制、未系统评估其他酮体或葡萄糖/胰岛素信号变化。未来应优先推动KD和β-HB在BCa中的临床转化，探讨患者对饮食反应的异质性及与现有疗法的联合疗效。

**研究结论部分**
总之，本研究表明生酮饮食及其介质β-羟基丁酸通过直接肿瘤抑制和免疫调节在膀胱癌中发挥肿瘤抑制效应。这些发现支持进一步的机制研究和验证，以推动生酮方法作为免疫治疗佐剂的转化评估。