高尿酸通过CCDC90B介导的线粒体质量控制失衡促进干细胞Leydig细胞衰老

《Cell Proliferation》：High Uric Acid Promotes Stem Leydig Cell Senescence by CCDC90B Mediates Mitochondrial Quality Control Imbalance

　　

高尿酸血症（Hyperuricemia）是一种常见的代谢性疾病，也是男性低睾酮水平的重要危险因素。干细胞Leydig细胞（Stem Leydig Cells, SLCs）的功能稳态对维持睾酮水平至关重要，但高尿酸（Uric Acid, UA）水平影响SLC功能的潜在分子机制尚待阐明。本研究在单细胞RNA测序（Single-Cell RNA Sequencing, scRNA-seq）水平上揭示了SLCs在高尿酸条件下表现出衰老特征。机制研究表明，UA与CCDC90B结合，导致其在细胞内显著累积，加剧钙离子（Ca²⁺）向线粒体流入，引发线粒体质量控制（Mitochondrial Quality Control, MQC）失衡。此外，在类器官和转基因小鼠水平上，研究人员观察到AAV8-CCDC90B处理后SLC衰老得到缓解且睾酮显著恢复。综上所述，这些结果提示高尿酸下的SLC衰老以MQC依赖性方式调控，CCDC90B是关键调控靶点，同时AAV介导的基因治疗可能为低睾酮患者提供有前景的治疗策略。

本研究旨在探究高尿酸血症与男性低睾酮水平之间的分子关联机制。睾酮主要由Leydig细胞（Leydig Cells, LCs）合成，对男性生殖发育、精子发生及全身代谢稳态至关重要，而SLCs作为LCs的前体细胞，通过精密的自我更新与分化调控维持LCs种群及内分泌功能。既往研究表明，代谢性疾病如肥胖、胰岛素抵抗及代谢综合征与男性睾酮水平降低密切相关，高尿酸血症作为代谢异常的核心组分，其对SLC功能的影响尚不明晰。同时，线粒体质量控制（MQC）涵盖线粒体生物发生、动力学（融合与分裂）及线粒体自噬（Mitophagy），是维持干细胞功能与命运决定的关键，但MQC在SLC分化中的调控作用及其被高尿酸破坏的机制仍有待揭示。

研究人员利用Uox基因敲除（Uox^?/?）高尿酸血症小鼠模型，结合单细胞转录组学、药物亲和响应靶点稳定性（Drug Affinity Responsive Target Stability, DARTS）筛选、蛋白质组学、体外细胞培养、睾丸类器官及腺相关病毒8型（Adeno-Associated Virus 8, AAV8）介导的基因干预等技术手段，系统解析了高尿酸诱导SLC衰老的分子机制，并探索了靶向CCDC90B的治疗潜力。研究证实，高尿酸环境下UA与线粒体内膜蛋白CCDC90B直接结合，抑制其泛素化降解途径，导致CCDC90B异常累积，进而引发线粒体钙超载及MQC失衡，最终驱动SLC衰老与睾酮合成障碍；而通过shRNA或AAV8靶向敲降CCDC90B可有效缓解SLC衰老并恢复睾酮水平。该成果发表于《Cell Proliferation》，为高尿酸关联性男性生殖功能障碍提供了新的治疗靶点与策略。

研究主要采用以下关键技术方法：Uox^?/?小鼠模型（C57BL/6J背景）构建高尿酸血症动物模型；流式细胞术分选CD51⁺ SLCs；scRNA-seq（样本为3只野生型及3只Uox^?/?小鼠睾丸，共67,697个细胞）进行细胞亚群鉴定与功能富集分析；DARTS联合质谱鉴定UA靶蛋白；CCK-8法确定UA工作浓度；免疫荧光、Western Blot及qPCR检测分子标志物；JC-1、MitoSOX Red、CellROX Green及RHOD-2 AM等荧光探针分别检测线粒体膜电位、线粒体ROS、细胞ROS及线粒体钙离子；透射电子显微镜观察线粒体超微结构；克隆球形成实验评估细胞增殖能力；ELISA检测睾酮及cAMP水平；以及基于Alves-Lopes等报道方法构建的睾丸类器官模型和AAV8睾丸间质注射干预。

2.1 高尿酸血症小鼠睾酮水平下降及SLC分化功能障碍

研究人员通过H&E染色发现Uox^?/?小鼠睾丸间质面积显著缩小，血清及睾丸睾酮水平明显降低。流式细胞术显示LCs数量减少且更易发生细胞死亡，而分离培养的LCs体外睾酮合成能力无显著差异，提示SLC功能异常可能导致LCs池补充不足。进一步诱导分化实验表明，Uox^?/?来源SLCs的LC标志物（CYP11A1、CYP17A1、HSD3β、STAR）表达显著降低，证实高尿酸诱导的低睾酮与SLC分化功能障碍相关。

2.2 高尿酸血症小鼠睾丸中观察到SLC衰老

对scRNA-seq数据进行聚类分析，发现Uox^?/?小鼠睾丸中LCs和SLCs比例下降。GO及GSEA分析显示SLCs中衰老相关基因富集，衰老评分升高。体外分离培养验证，Uox^?/?组SA-β-gal阳性细胞显著增多，p16⁺及p21⁺ SLCs比例上升，衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）因子（IL-1α、IL-6、CXCL15、MMP-14）表达上调。同时，Uox^?/?小鼠睾丸中ROS及炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）水平显著升高，表明组织炎症可能加剧UA对SLCs的损害。

2.3 高尿酸环境促进SLC衰老并抑制其功能

以2.944 mM UA建立体外高尿酸环境，CCK-8确定该浓度下SLCs分化及产睾酮能力随UA浓度增加而递减。UA处理后SA-β-gal阳性率显著升高，p16、p21、p53蛋白水平上调而p-RB水平下降，ROS水平增加，SASP因子表达上调。功能学实验显示，高尿酸环境下SLCs克隆球形成能力减弱，诱导分化后LC标志物表达降低，cAMP/PKA信号通路激活水平下降，证实高尿酸通过诱导SLC衰老导致低睾酮。

2.4 CCDC90B介导高尿酸环境下SLC的线粒体质量控制失衡

DARTS联合蛋白质组学筛选鉴定CCDC90B为UA最显著差异表达的靶蛋白。分子对接显示UA结合于CCDC90B可成药口袋，Western Blot证实UA处理后CCDC90B蛋白水平显著升高，Co-IP实验表明UA降低了CCDC90B的泛素化降解。RHOD-2 AM检测显示高尿酸条件下线粒体钙含量显著升高。透射电镜观察发现UA组线粒体网络碎片化，线粒体自噬水平改变，COX2与LAMP1共定位分析提示mitophagy增强；MitoSOX Red及细胞内氧化还原蛋白检测显示线粒体ROS升高；JC-1及ATP检测表明线粒体膜电位降低、ATP生成减少，证实CCDC90B介导的MQC失衡参与高尿酸诱导的SLC衰老。

2.5 干扰CCDC90B缓解高尿酸条件下SLC衰老并恢复其分化功能

shRNA敲降CCDC90B（shC）后，UA诱导的SA-β-gal阳性细胞减少，p53、p21、p16蛋白水平降低而p-RB升高，SASP因子表达受抑。MQC方面，shC降低线粒体钙含量，改善线粒体碎片化，减少线粒体ROS，恢复膜电位及ATP生成。功能上，shC显著恢复高尿酸环境下SLCs的增殖能力，LC标志物表达回升，cAMP/PKA通路激活水平及睾酮产量增加，表明高尿酸诱导的SLC衰老以MQC依赖性方式发生，CCDC90B起关键调控作用。

2.6 靶向CCDC90B通过线粒体质量控制挽救高尿酸抑制的睾丸类器官

基于Alves-Lopes等方法构建睾丸类器官，AAV8特异性靶向SLCs和LCs。高尿酸条件下类器官生长受阻，生精小管样结构不明显；AAV8介导的CCDC90B干扰降低线粒体钙水平，减少p16、p21、p53蛋白，升高p-RB，抑制SASP因子表达，上调LC标志物，显著提升培养基中睾酮浓度，证实靶向CCDC90B可挽救高尿酸损伤的睾丸类器官功能。

2.7 AAV8介导的CCDC90B下调提高睾酮水平并减弱高尿酸促进SLC衰老的效应

睾丸间质注射AAV8实现SLCs靶向敲降CCDC90B。H&E染色显示Uox^?/?+AAV-C组睾丸间质面积增加，LCs数量及LC标志物表达显著回升，血清及睾丸睾酮水平升高。MQC相关检测表明线粒体钙含量、ROS水平降低，膜电位及ATP水平恢复。SLC衰老方面，SA-β-gal阳性细胞减少，p16、p21、p53及SASP因子表达下调，p-RB升高，证实AAV8靶向CCDC90B可缓解Uox^?/?小鼠SLC衰老并提升睾酮水平。

讨论部分指出，代谢性疾病与男性生殖功能障碍密切相关，但高尿酸血症的作用既往不明。本研究首次揭示高尿酸微环境是驱动SLC衰老的关键因素，其机制在于UA与CCDC90B结合抑制其降解，导致异常累积、线粒体钙超载及MQC失衡。靶向敲降CCDC90B可显著缓解SLC衰老，为临床提供了潜在治疗靶点。

研究同时强调，细胞衰老与干细胞稳态破坏密切相关，代谢应激可直接驱动干细胞功能障碍。线粒体稳态对干细胞功能至关重要，MQC失衡导致ROS过度积累及细胞损伤。本研究发现高尿酸破坏SLCs的MQC，表现为线粒体ROS增加、膜电位降低、形态改变及mitophagy异常，伴随MQC调节因子和抗氧化酶下调，支持了MQC依赖性SLC衰老机制。CCDC90B作为含卷曲螺旋结构域的线粒体内膜蛋白，既往被认为参与线粒体动力学和能量代谢，本研究通过DARTS技术首次将其鉴定为UA结合靶点，揭示了其在生殖生物学及MQC中的新功能。

睾丸类器官作为三维培养系统，可有效模拟体内组织的关键结构、多细胞组成及微环境信号，较传统二维培养更能保留细胞间相互作用和局部微环境线索，是评估基因治疗策略的重要模型。研究坦诚存在局限：CCDC90B泛素化干扰的具体分子机制、其他代谢疾病模型中的验证、高尿酸对LCs功能的直接影响，以及临床转化疗效均有待进一步研究。

研究结论部分指出，本研究进一步证实SLC衰老是高尿酸血症诱导睾酮缺乏的主要驱动因素。在SLC衰老的关键调控因子中，UA诱导的CCDC90B累积破坏MQC，从而促进SLC衰老。这些发现将CCDC90B和线粒体钙稳态定位为连接全身代谢紊乱与睾丸衰老的关键节点。通过将SLC衰老与线粒体稳态相联系，并提出CCDC90B抑制作为恢复功能性SLCs和睾酮产生的策略，本研究为睾丸内分泌调节提供了新见解。此外，靶向UA-CCDC90B轴可能不仅是治疗高尿酸相关低性腺功能减退症的有前景方法，也可能适用于更广泛的年龄相关性类固醇生成功能衰退。总之，本研究揭示了SLC衰老的新型MQC依赖性机制，并支持精准AAV为基础的SLC靶向治疗在线粒体相关睾丸内分泌疾病中的临床转化。