《Poultry Science》：Single-cell transcriptome profiling of primordial germ cells reveals differences between right and left gonads in chickens
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在雌性鸟类中，左侧卵巢发育，而右侧性腺发生退化。早期性腺分化过程中，两侧原始生殖细胞（PGCs）是否存在差异及其差异形成机制仍不清楚。研究人员对HH29和HH34时期雌性鸡胚右侧与左侧性腺进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。在质量控制后，对细胞进行聚
在雌性鸟类中，左侧卵巢发育，而右侧性腺发生退化。早期性腺分化过程中，两侧原始生殖细胞（PGCs）是否存在差异及其差异形成机制仍不清楚。研究人员对HH29和HH34时期雌性鸡胚右侧与左侧性腺进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。在质量控制后，对细胞进行聚类，比较PGCs的转录程序，开展基因本体（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析及细胞通讯分析，并通过实时定量PCR（qPCR）对相关基因进行验证。研究发现，在HH29时期，右左两侧PGCs差异主要富集于DNA损伤应答、p53介导的细胞周期阻滞、核糖体以及翻译相关条目。KEGG通路包括核糖体、泛素介导的蛋白水解和氧化磷酸化。在HH34时期，这种差异转向细胞衰老、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路和程序性坏死（necroptosis）。JUN、ID2、GADD45A和GTSE1等基因呈差异表达。跨发育时期分析显示，右侧PGCs还额外富集于类固醇激素生物合成、雌激素信号通路和卵巢类固醇生成。细胞—细胞通讯分析表明，在两个时期内，仅右侧性腺中存在体细胞—PGCs之间的NOTCH通路相互作用。单细胞图谱揭示，右左PGCs差异具有阶段依赖性：HH29时期以DNA损伤/细胞周期程序为主，至HH34时期转变为衰老相关程序，并伴随右侧特异性的NOTCH相互作用。这些数据为理解鸟类卵巢不对称发育过程中PGCs命运的微环境调控提供了见解。
该文发表于《Poultry Science》，聚焦雌性鸡胚左右性腺不对称发育过程中原始生殖细胞（PGCs，生殖系前体细胞）的分子差异。鸟类雌性通常仅左侧性腺发育为功能性卵巢，而右侧性腺在胚胎期逐渐退化，这种显著的左右不对称性早已在形态学和部分体细胞调控因子层面得到认识。然而，定植于左右性腺中的PGCs是否已经表现出不同的转录状态，以及这种差异如何随发育推进而变化，仍缺乏直接证据。既往研究多集中于左右性腺体细胞差异、雄雌PGCs差异或跨物种比较，对“同一雌性胚胎内左右两侧PGCs命运分化”的认识不足。因此，开展该研究的意义在于，从单细胞分辨率解析PGCs在不对称性腺环境中的阶段性变化，从而补充鸟类卵巢偏侧发育的细胞与分子机制。
研究人员选取雌性鸡胚HH29和HH34两个关键时期进行分析。HH29对应性腺分化启动后不久，HH34则是左右形态不对称已较明显的阶段。通过对左右性腺整体组织进行单细胞转录组测序，研究人员首先建立了胚胎性腺细胞图谱，界定PGCs及多类体细胞群体，随后在PGCs群内比较左右差异，并进一步分析发育阶段变化、功能富集特征与细胞间通讯网络，最后采用qPCR对差异基因进行验证。研究结论表明，左右性腺PGCs的差异并非静态，而是具有明确的阶段依赖性：在HH29阶段，差异主要集中于DNA损伤应答、细胞周期调控、蛋白质翻译与线粒体能量代谢；至HH34阶段，则转向细胞衰老、氧化应激相关处理、cAMP信号以及程序性坏死等程序。同时，右侧性腺中的PGCs在两个时期均表现出右侧特异性的NOTCH信号相关体细胞互作，提示右侧微环境可能通过特定信号轴参与PGCs命运调控。该研究的重要意义在于，将鸟类雌性性腺左右不对称现象从体细胞层面进一步推进到生殖细胞层面，揭示了PGCs对局部微环境与发育阶段变化的响应规律，为阐明鸟类卵巢不对称形成机制提供了新的转录组学依据。
在技术方法方面，研究人员以广西麻鸡受精蛋为材料，分离E6（HH29）与E8（HH34）雌性胚胎左右性腺，并通过CHD1基因PCR进行性别鉴定。随后利用10x Genomics Chromium Single Cell 3′ v3.1平台开展单细胞RNA测序（scRNA-seq），采用Cell Ranger与Seurat进行比对、质控、聚类和差异表达分析，借助GO/KEGG进行功能注释，使用CellChat推断配体—受体介导的细胞通讯，并以qPCR对候选差异基因进行表达验证。
在“Single-cell atlas and annotation of gonadal cell populations”部分，研究人员构建了雌性鸡胚左右性腺的单细胞图谱。质量控制后，共保留47,750个细胞用于后续分析。基于统一流形近似与投影（UMAP）聚类，细胞被划分为13个转录学上不同的细胞簇。借助已知标志基因，研究人员将其中一个簇鉴定为生殖细胞/PGCs簇，其高表达DAZL和DDX4（VASA）等经典生殖细胞标志。其余簇包括间质—上皮细胞、前颗粒细胞、内皮细胞、支持细胞、间皮细胞以及若干性腺外相关细胞类型。该结果说明，在HH29与HH34时期，胚胎性腺已经具备由多种体细胞谱系共同构成的PGCs生态位（niche，局部微环境），且PGCs在总细胞中占比较低，为后续从复杂微环境中解析PGCs特异差异奠定基础。
在“Right–left PGCs differences at HH29 highlight DNA damage and cell-cycle programs”部分，研究人员比较HH29时期左右性腺PGCs的差异表达特征，鉴定出332个差异表达基因。GO富集分析显示，这些差异基因主要涉及DNA损伤应答、由p53类介导因子导致的细胞周期阻滞、核糖体结构组成、翻译及翻译延伸因子活性。KEGG分析进一步显示，相关差异显著富集于核糖体、泛素介导的蛋白水解、非同源末端连接、细胞周期和氧化磷酸化等通路。GTSE1、PPA1、RPLP1和RPS15A等基因参与其中。由此可见，在性腺不对称尚处于较早阶段时，左右两侧PGCs的差异首先体现为基因组稳定性维持、细胞周期推进/阻滞平衡、蛋白质合成能力以及线粒体代谢状态的不同，提示右左微环境已对PGCs产生早期影响。
在“Right–left PGC differences at HH34 shift toward senescence-associated programs”部分，研究人员对HH34时期左右PGCs进行分析，发现379个差异表达基因。GO条目主要富集于细胞氧化剂解毒、蛋白异源寡聚化、有机酸结合及核糖体结构成分。KEGG分析则显示，差异重点转向细胞衰老、cAMP信号通路和程序性坏死。代表性差异基因包括ID2、JUN、CCND1、GADD45A和MAP2K1。该结果表明，随着左右性腺形态差异加剧，PGCs的分子差异已不再主要局限于早期增殖与翻译活动，而是更多关联至应激应答、衰老样程序和受调控的细胞死亡过程。这一变化与右侧性腺逐步退化的整体发育背景相一致。
在“Pathway features of right-side PGCs across stages”部分，研究人员进一步仅聚焦右侧性腺PGCs在不同阶段的变化，共鉴定出500个差异表达基因，其中上调300个、下调200个。KEGG富集结果显示，这些变化除了涉及核糖体、氧化磷酸化和细胞周期外，还显著涉及类固醇激素生物合成、雌激素信号通路和卵巢类固醇生成。该发现提示，右侧PGCs在发育推进过程中可能更强烈地暴露于或响应于类固醇生成相关信号，同时伴随代谢和增殖相关程序的重塑，反映出右侧性腺环境对PGCs的持续塑造作用。
在“Cellular crosstalk among various cell types in embryonic gonads”部分，研究人员利用CellChat分析左右性腺中不同细胞类型之间的通讯网络。结果显示，HH29时右侧性腺预测到的细胞互作数量高于左侧，而到HH34时这一模式反转，右侧少于左侧；同时，HH34右侧相较HH29右侧出现明显的互作数量下降。这提示随着发育进行，右侧性腺的信号连接性发生削弱或重塑。全部细胞类型间共鉴定出260对配体—受体和54条信号通路，其中与生殖细胞密切相关的通路包括MK、NOTCH、NEGR、NCAM、SEMA5、EPH-β、LAMININ、IGF、FGF、FN1和CADM，表明PGCs与其周围体细胞之间存在丰富而复杂的信号交换。
在“Interactions mediated by the NOTCH and NCAM signaling pathways”部分，研究人员重点分析了NOTCH与NCAM信号。NOTCH通路网络中心性分析表明，内皮细胞和支持细胞是主要配体来源，且在HH29与HH34两个时期，只有右侧性腺中的内皮细胞被预测与生殖细胞形成直接NOTCH相关互作，左侧未见此模式。NCAM通路中，间皮细胞、间质—上皮细胞和前颗粒细胞是主要配体来源；HH29时以间皮细胞主导，而到HH34时，间质—上皮细胞、前颗粒细胞甚至生殖细胞本身也参与到互作中。除此之外，LAMININ、IGF、FGF和CADM等通路同样连接体细胞与PGCs。该部分结果说明，胚胎性腺中PGCs并非孤立存在，而是在多条黏附、基质和生长因子相关通路共同构建的局部微环境中接受调控，其中NOTCH互作的右侧特异性尤为突出。
在“Validation of scRNA-seq Data by qPCR in right and left gonadal PGCs”部分，研究人员选取10个差异表达基因进行qPCR验证。HH29时，右侧PGCs中GTSE1和PPA1显著上调，而与核糖体相关的RPLP1和RPS15A下调；HH34时，ID2、GADD45A、CCND1、COL1A1、JUN和MAP2K1在右侧PGCs中上调。qPCR检测到的表达变化方向与scRNA-seq结果一致，支持了单细胞测序分析的可靠性。这些被验证的基因分别对应细胞周期、DNA损伤应答、分化调控与细胞外基质组织等过程，为左右PGCs差异的功能解释提供了实证支持。
讨论部分强调，PGCs作为精原细胞和卵原细胞前体，在禽类种质保存和生殖工程中具有核心意义，而雌性鸟类左右性腺发育不对称为研究PGCs命运调控提供了天然模型。研究人员认为，本研究显示HH29时左右PGCs差异首先表现为细胞周期推进、DNA损伤应答和核糖体发育等基础程序差异；到HH34时，右侧PGCs更明显地表现出与细胞周期阻滞、细胞衰老和凋亡相关的转录特征。结合细胞通讯分析，右侧性腺在发育过程中信号互作减少，且NOTCH介导的体细胞—PGCs互作仅见于右侧，提示局部生态位变化可能参与右侧PGCs生存、增殖能力下降。作者同时指出，NCAM以及LAMININ、IGF、FGF、CADM等信号共同构成了PGCs周围多层次调控网络，反映胚胎性腺中体细胞谱系对PGCs微环境的持续塑造。整体而言，讨论部分将转录差异与微环境信号联系起来，强调右侧退化性腺中的PGCs并非被动伴随变化，而是表现出与局部信号状态相一致的阶段性分子响应。
研究结论部分可译为：雌性鸡胚性腺的单细胞转录组学揭示，左右性腺PGCs差异在HH29时期主要由DNA损伤和细胞周期程序主导，而至HH34时期则转变为衰老相关程序。细胞—细胞通讯推断进一步突出显示，在两个发育阶段中，体细胞区室与PGCs之间存在右侧特异性的NOTCH相互作用。这些发现界定了PGCs转录组及其微环境的阶段依赖性和侧别特异性特征，为后续通过机制性实验检验生态位信号和应激通路如何塑造鸟类卵巢不对称发育中的生殖细胞命运提供了基础。
