超声辅助疏水性低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvent, DES)提取虾青素(Astaxanthin, AST)：工艺优化及抗衰老活性评价

《Foods》：Ultrasonic-Assisted Extraction of Astaxanthin Using Hydrophobic Deep Eutectic Solvent: Process Optimization and Anti-Aging Activity Evaluation

　　

摘要：低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvent, DES)萃取是一项绿色高效技术，作为有机溶剂的替代品，DES广泛用于中药活性成分提取。本研究建立了一种以超声辅助低共熔溶剂(Ultrasound-Assisted Deep Eutectic Solvents, DESs-UAE)从深红酵母(Phaffia rhodozyma, PR)中提取虾青素(Astaxanthin, AST)的环境友好、高效方法。采用高效液相色谱(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)测定虾青素含量。制备并评估了6种由DL-薄荷醇(DL-menthol)与选定氢键供体(Hydrogen Bond Donor, HBD)组成的低共熔溶剂，其中DL-薄荷醇–乙酸体系表现出更优的萃取性能。采用响应面法(Response Surface Methodology, RSM)优化萃取参数(超声功率、时间、温度)，最优条件为：超声功率420 W、超声时间20 min、超声温度60 ℃，AST提取率达62%(2.49 mg/g)。与常规有机溶剂提取相比，除二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)外，DES对PR中AST的提取率显著更高。扫描电镜(Scanning Electron Microscopy, SEM)分析表明DES-UAE处理破坏了PR的细胞结构，产生大量表面孔隙，促进胞内生物活性成分释放，显著提高AST提取效率。PR提取物无明显细胞毒性，可有效促进L929细胞增殖；能浓度依赖性升高H2O2诱导氧化应激L929细胞中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性、降低丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量，从而缓解氧化损伤；还可浓度依赖性上调Ⅰ型胶原蛋白表达，改善胶原合成功能下降，发挥抗细胞氧化损伤保护作用。本研究为有毒溶剂提供了绿色替代方案，为天然产物提取及深红酵母(Phaffia rhodozyma, PR)的高值化利用提供了重要理论与实验支撑。

论文解读：超声辅助疏水性低共熔溶剂提取深红酵母中虾青素及其抗衰老活性研究

该研究发表于《Foods》。虾青素(Astaxanthin, AST)属类胡萝卜素中的叶黄素类，具强抗氧化、抗炎等活性，天然AST主要来源于深红酵母(Phaffia rhodozyma, PR)、微藻等。PR因细胞壁厚致AST难提取，传统有机溶剂（甲醇、丙酮等）存在毒害、残留及低效率问题。疏水性低共熔溶剂(Hydrophobic Deep Eutectic Solvent, HDES)可匹配脂溶性AST的溶解特性，且较离子液体低毒可降解。目前针对HDES从PR中提取AST及提取物的抗衰老生物活性关联研究尚少。研究人员以DL-薄荷醇为氢键受体(Hydrogen Bond Acceptor, HBA)、不同有机酸为氢键供体(Hydrogen Bond Donor, HBD)构建HDES，结合超声辅助提取(Ultrasound-Assisted Extraction, UAE)，通过单因素及响应面法(Response Surface Methodology, RSM)优化工艺，结合SEM、傅里叶变换红外光谱(Fourier-Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR)解析作用机制，并以H₂O₂诱导L929细胞氧化衰老模型评价提取物的细胞安全性、抗氧化及Ⅰ型胶原调控作用。

研究人员选用深红酵母(Phaffia rhodozyma, PR)菌体为原料，制备6种DL-薄荷醇基二元HDES并筛选最优体系；通过单因素实验考察DES摩尔比、液料比、超声功率、时间、温度的影响，在此基础上以超声功率(A)、时间(B)、温度(C)为变量进行Box–Behnken设计响应面优化；以HPLC定量AST；将最优DES-UAE提取物与常规有机溶剂提取效果对比；采用SEM观察处理前后PR细胞微观形貌，FT-IR验证DES分子间氢键形成；提取物经大孔吸附树脂纯化后，用CCK-8法检测L929细胞增殖毒性，以H₂O₂造氧化损伤模型，测定胞内SOD活性、MDA含量及上清Ⅰ型胶原浓度。

3.1. 方法学验证(Methodological Validation)

通过HPLC建立AST标准曲线，回归方程为Y = 64.44X + 1.7117 (r = 0.9995)，线性范围0.13～2.65 μg/mL；精密度、重复性、稳定性RSD均＜2%；LOD ≤ 0.548 μg/mL，LOQ = 1.827 μg/mL；平均加样回收率95.522%～103.731%；耐用性良好，证实该方法可靠可用于后续定量。

3.2. DES筛选(Screening of DES)

对6种DL-薄荷醇–有机酸HDES的AST提取率比较，DL-薄荷醇–乙酸(DL-menthol–acetic acid)体系提取率最高，选作后续实验用DES。

3.3. 单因素实验结果(Results of Single-Factor Experiments)

固定其他条件逐一考察变量：DL-薄荷醇与乙酸摩尔比1:3时AST提取率最高，确定DES组成为摩尔比1:3；液料比(g/mL)增至1:100后提取率不再显著上升，选1:100；超声功率400 W提取率最高(＞60%)；超声时间20 min时最高，延长则略降；超声温度60 ℃时最高。据此确定RSM三因素范围。

3.4. 响应面模型结果(Results of Response Surface Model)

拟合得二次多项回归方程Y = 61.52 + 1.24A + 2.76B + 1.37C ? 0.56AB + 2.16AC ? 1.67BC ? 2.63A²? 8.82B²? 8.76C²。模型极显著(p = 0.0003)，失拟项不显著(p = 0.4686)，R²= 0.9653，Adj-R²= 0.9207，信噪比4.04，具预测价值。因素影响程度：超声时间(B)＞超声温度(C)＞超声功率(A)。

3.5. 最优提取条件验证(Validation of Optimal Extraction Conditions)

模型预测最优为426.19 W、21.39 min、60.97 ℃，理论提取率61.94%；结合实际调整为超声功率420 W、时间20 min、温度60 ℃，三次平行实测平均提取率62.08%(2.49 mg/g)，工艺稳定重现性好。

3.6. 与传统溶剂对比(Results of Comparison with Conventional Extraction Solvents)

除二甲基亚砜(DMSO)外，DES对PR中AST提取率显著高于甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮，提升幅度最高达55.68%；DMSO与DES提取率相当(均＞60%)，但DMSO毒性高，DES具低毒可生物降解优势。

3.7. SEM分析结果(Results of SEM Analysis)

未处理PR细胞完整光滑；DES-UAE处理后细胞严重破碎，表面呈蜂窝状多孔结构，ImageJ定量孔隙率从未处理组2.38±0.008%升至DES处理组22.75±2.906%；水–UAE及醇–UAE仅致轻微粗糙或中等孔隙，证实DES联合超声有效破坏酵母细胞壁促进胞内AST释放。

3.8. FT-IR分析结果(Results of FT-IR Analysis)

DL-薄荷醇–乙酸混合DES中，乙酸C=O伸缩振动峰从1711.1 cm^?1红移至1709.1 cm^?1，O–H与C–H区亦有位移，表明DL-薄荷醇与乙酸分子间形成氢键；低于2000 cm^?1主要官能团吸收峰无显著变化，DES分子结构在提取过程中稳定。

3.9. 体外抗氧化活性(In Vitro Antioxidant Activity of PR Extract on L929 Cells)

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  3.9.1. 细胞增殖评价(Evaluation of Cell Proliferation)：CCK-8结果显示20～100 μmol/L浓度下细胞存活率＞100%，40～80 μmol/L显著促L929增殖(100 μmol/L时达117.27%)，120 μmol/L时略降至95.91%无显著毒性，提取物在此范围安全且有促增殖作用。
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  3.9.2. 对氧化损伤L929细胞抗氧化指标的影响(Effect of PR Extract on Antioxidant Indicators of Oxidatively Damaged L929 Cells)：H₂O₂模型组SOD活性显著降低、MDA升高；加入PR提取物后SOD活性浓度依赖性回升、MDA浓度依赖性下降，80 μmol/L效果最显著，证实提取物缓解H₂O₂诱导氧化损伤。
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  3.9.3. 对衰老细胞胶原表达的调控(Regulation of PR Extract on Collagen Expression in Senescent L929 Cells)：模型组Ⅰ型胶原含量极显著降低；各浓度PR提取物处理组Ⅰ型胶原浓度依赖性升高(p＜0.001 vs 模型组)，80 μmol/L上调效应最强，表明提取物改善氧化应激致胶原合成功能衰退。

讨论与结论总结(Discussion and Conclusions)

研究人员指出，疏水性DES较亲水性DES更适合脂溶性AST提取，DL-薄荷醇–乙酸(1:3)因短碳链匹配AST溶解性、适宜氢键网络及较低黏度具最佳萃取能力。单因素结合RSM优化得最优工艺(420 W，20 min，60 ℃，液料比1:100 g/mL)，AST提取率62%，显著高于多数常规有机溶剂并与DMSO相当，但DES低毒可生物降解且无DMSO本身抗氧化干扰细胞实验的缺陷。SEM证实DES-UAE破坏PR细胞壁形成多孔结构系提取率提升的结构机制。细胞实验验证提取物安全、促L929增殖，通过提升SOD、降低MDA及上调Ⅰ型胶原拮抗H₂O₂致氧化损伤与胶原丢失，提示其潜在抗皮肤光老化应用价值。DL-薄荷醇与乙酸价廉易得，DES可一步混合制备且可循环相分离回用，超声辅助缩短工时降能耗，具备工业化放大基础。该研究表明疏水性DES联合UAE是从PR中绿色高效提取脂溶性活性物质的可行策略，为天然产物绿色提取及PR高值化利用提供理论和技术依据。