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《Foods》：Cross-Category Screening of Food Samples for Amyloid-β42 Aggregation-Inhibitory Activity Using a Microliter-Scale High-Throughput Screening System with Quantum-Dot-Labeled Aβ

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）与淀粉样β（amyloid-β，Aβ）的聚集和沉积密切相关，因此Aβ聚集已成为AD相关研究中的重要靶点。食品来源成分因其可能调节Aβ相关过程而受到关注，但多种食品样品对Aβ42聚集的直接影响仍不明确。研究人员采用基于量子点标记Aβ（quantum-dot-labeled Aβ，QDAβ）的自动化微升级高通量筛选系统（microliter-scale high-throughput screening，MSHTS），对来源于115种食品的120份食品样品制备物进行了Aβ42聚集抑制活性筛选。在初筛样品中，34份样品显示出可检测的Aβ42聚集抑制活性，其中12份被归类为高活性样品（1/EC50 ≥ 10 mL/mg）。在本次筛选集合中，高活性样品在茶相关样品中出现频率较高。研究人员选取红茶、卡芒贝尔奶酪、红紫苏和黑大豆作为代表性命中样品开展进一步验证。自动化MSHTS图像及剂量-反应数据表明，这些样品可随浓度升高而抑制Aβ42聚集体形成。硫黄素T（thioflavin T，ThT）检测和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）进一步支持了这些抑制效应，结果显示ThT阳性的纤维状聚集受到抑制，且纤维状聚集体形成减少。在分化PC12细胞中，所选食品样品在部分浓度条件下提高了Aβ42处理细胞的细胞活力。这些发现为功能性食品研究以及食品来源Aβ42聚集调节因子的活性成分分析提供了基础。

该论文发表于《Foods》，研究聚焦于阿尔茨海默病（AD）关键病理过程之一——淀粉样β42（Aβ42）聚集的食品来源调控因子筛选。AD是最常见的痴呆类型，其病理学特征之一是Aβ逐步由单体组装为寡聚体、原纤维和成熟纤维，并进一步形成老年斑。由于Aβ42较Aβ40更易聚集，且其聚集过程与神经毒性及疾病发生密切相关，因此寻找能够抑制Aβ42聚集的物质，既具有疾病机制研究意义，也具有预防干预探索价值。尽管近年来去除Aβ沉积的抗Aβ抗体治疗已取得临床进展，但其主要适用于早期AD患者，且更多体现为延缓病程而非逆转已形成的认知损害。与此同时，AD相关Aβ沉积和神经退行性生物标志物改变通常在临床症状出现前数十年即已开始，因此开发能够在症状显现前调节Aβ相关过程的预防策略尤为重要。

在这一背景下，食品及食品来源成分因其日常摄入属性而成为功能性食品研究的重要方向。既往流行病学研究提示地中海饮食、MIND饮食和日本饮食模式与认知下降或痴呆风险相关，多领域生活方式干预研究也将营养作为预防策略的重要组成部分。然而，这类研究通常难以直接回答究竟是哪些具体食品样品或何种食品来源成分可直接影响Aβ42聚集。加之食品本身是复杂多组分基质，其Aβ42聚集抑制活性可能受到食品种类、加工方式、提取条件和储存状态等多重因素影响，因此，有必要建立一种能够在统一条件下对不同类别食品进行横向比较的体外筛选体系。研究人员指出，传统依赖ThT或刚果红等Aβ结合染料的方法，易受样品共存成分和内滤效应影响，可能产生假阳性。为此，本研究使用此前建立的QDAβ可视化微升级高通量筛选平台，通过荧光图像异质性定量Aβ42聚集，从而提高复杂食品样品初筛的可比性和适用性。

在技术方法方面，研究人员首先由Air Water Inc.协助收集并制备食品样品，共纳入来源于115种食品的120份样品制备物，部分食品因制备或储存条件不同而作为独立样品处理。样品经均质、冻干后，以50%乙醇统一提取并重溶于DMSO。随后使用自动化MSHTS平台，在1536孔板中将QDAβ与未标记Aβ42共孵育，通过荧光图像像素强度标准差评估聚集程度，并用五参数Logistic模型计算EC50。对代表性命中样品，进一步采用ThT检测纤维化聚集、TEM观察聚集体形态，并在经神经生长因子（NGF）处理24 h的分化PC12细胞中，借助MTT法评估Aβ42处理背景下的细胞活力变化。

在结果部分，论文首先以“3.1. Primary Automated MSHTS Identifies Food Samples with Inhibitory Activity Against Aβ42 Aggregation”为题，报道了自动化MSHTS初筛结果。研究人员对120份食品样品制备物进行了系统筛选，发现34份样品具有可检测的Aβ42聚集抑制活性，提示不同食品间活性差异显著。以1/EC50作为活性指标排序后，红茶等样品表现出较高抑制活性。研究人员进一步将1/EC50 ≥ 10 mL/mg定义为高活性，共有12份样品达到该标准。按大类描述性统计后可见，高活性样品在茶相关样品中出现频率最高；蔬菜、发酵食品和豆类中亦有少量高活性样品，而水果、动物来源食品及其他加工食品中未见高活性样品。基于活性水平及食品类别代表性，研究人员选取红茶、卡芒贝尔奶酪、红紫苏和黑大豆作为后续验证对象。自动化MSHTS图像显示，在Aβ42单独孵育条件下，荧光强度高度不均一，提示聚集体形成明显；加入代表性命中食品后，随样品浓度增加，荧光图像趋于均一，说明Aβ42聚集体形成受到抑制。浓度-反应曲线进一步证明这些代表性样品具有浓度依赖性的Aβ42聚集抑制效应。补充分析还显示，绿茶和焙茶同样具有较强活性，酱油和生酱油也与既往结果一致，表现出Aβ42聚集抑制作用。

在“3.2. Orthogonal Validation of Selected Hit Samples by ThT Assay and TEM”部分，研究人员使用正交验证策略确认自动化MSHTS所得命中结果的可靠性。ThT实验显示，所有代表性命中样品均可降低ThT荧光信号，说明其能够抑制ThT阳性的Aβ42纤维状聚集形成。将MSHTS与ThT所得EC50进行比较，红茶、红紫苏和黑大豆在两种方法中的结果总体一致，而卡芒贝尔奶酪则表现出超过一个数量级的差异，提示不同检测体系对聚集物种的敏感性可能不同。TEM形态学观察进一步证实，在Aβ42单独条件下可见明显纤维状聚集，而加入代表性命中食品后，纤维状结构减少，并伴有纤维断裂或其他形态改变。论文据此认为，自动化MSHTS筛选出的命中食品并非仅在图像学初筛中表现阳性，也确实在ThT阳性聚集形成和聚集体形态两个层面影响了Aβ42聚集过程。

在“3.3. Selected Hit, Follow-Up, and Reference Samples Show Increased Cell Viability in Aβ42-Treated Differentiated PC12 Cells”部分，研究人员转向细胞层面的探索性评估。通过MTT实验，比较各食品样品在Aβ42处理的分化PC12细胞中对细胞活力的影响。结果显示，不同样品对Aβ42诱导的细胞活力下降影响并不一致。红茶、红紫苏以及卡芒贝尔同类后续样品在某些条件下可提高细胞活力；生酱油和部分卡芒贝尔后续样品也在个别条件下出现改善，但未必呈现清晰的浓度依赖性。值得注意的是，黑大豆虽然在MSHTS和ThT中均显示Aβ42聚集抑制活性，但在分化PC12细胞中并未表现出明确的细胞活力改善。由此可见，Aβ42聚集抑制活性与细胞反应改善之间并不完全对应，提示细胞层面的效应不能仅由初筛中观察到的聚集抑制强度加以解释。

讨论部分对研究意义、结果解释与局限性进行了系统归纳。研究人员认为，本研究的重要贡献不在于分析某一种单一食品，而在于使用同一自动化MSHTS平台，对多类别食品进行标准化横向比较，并通过独立聚集检测及细胞实验完成逐步验证，为功能性食品候选物优先级排序提供了方法学框架。结果中茶类样品尤其突出，且与既往关于茶多酚、茶黄素和Aβ聚集抑制作用的报道一致；红紫苏命中结果也与此前关于紫苏叶提取物和迷迭香酸（rosmarinic acid）抑制Aβ相关过程的文献相呼应；黑大豆则可能与大豆异黄酮和花青素相关；卡芒贝尔奶酪则提示发酵乳制品来源肽类可能值得后续关注。不过，论文明确指出，本研究并未鉴定具体活性成分，也未进行总多酚、儿茶素、茶黄素、异黄酮或肽组分等前期成分分析，因此现阶段尚不能将观察到的效应归因于单一化合物。与此同时，蔬菜、水果、动物性食品等类别中多数样品未表现出明显Aβ42聚集抑制活性，这提示某些食品与认知功能改善之间的流行病学关联，可能更多涉及抗氧化、抗炎、代谢调节、血管功能或肠道菌群等其他机制，而不一定体现为对Aβ42聚集的直接抑制。

论文还特别强调了不同检测方法的互补性。MSHTS主要反映含QDAβ的较大聚集体在荧光图像中的空间异质性，ThT则更多反映ThT阳性聚集体的形成，包括一些难以在显微图像中清晰识别的小型或可溶性装配体，因此二者所得EC50不完全一致并不意外。卡芒贝尔奶酪在MSHTS与ThT中的较大差异，正说明不同食品样品可能影响不同聚集物种。细胞实验部分同样提示，仅凭聚集抑制并不足以预测细胞活力变化，因为Aβ细胞毒性不仅取决于聚集总量，也与可溶性寡聚体等特定毒性物种性质有关，同时食品成分本身亦可能对细胞代谢、氧化应激等产生直接影响。因此，Aβ42聚集抑制活性更适合作为食品来源候选物初筛指标，而非直接等同于细胞或体内保护效应。

论文结论部分可译为：本研究支持一种从筛选到验证的工作流程，用于优先遴选可调节Aβ42聚集的食品来源候选物。研究人员采用自动化MSHTS对来源于115种食品的120份食品样品制备物进行筛选，结果显示Aβ42聚集抑制活性存在显著差异，且在本次筛选集合中，高活性样品在茶相关样品中出现频率较高。包括红茶、卡芒贝尔奶酪、红紫苏和黑大豆在内的代表性命中样品在MSHTS中表现出浓度依赖性抑制效应，并得到ThT实验和TEM观察支持。MTT实验进一步表明，部分所选样品在某些浓度下可提高Aβ42处理细胞的细胞活力，同时也提示，基于MTT的细胞反应不能仅凭聚集抑制活性加以预测。然而，由于文中所报告的变异主要反映单次实验运行中的技术重复，而未涵盖实验间重复性，这些MTT结果应被视为有待进一步确认的探索性发现。总体而言，联合应用这些方法支持将自动化MSHTS用于初级候选物优先筛选，并结合正交聚集检测和探索性细胞评价开展后续验证。该研究为未来识别食品来源Aβ42聚集调节因子的活性成分及其机制评价提供了基础。