通过细胞表面展示纯化蛋白质谷氨酰胺酶及脱酰胺修饰磷虾蛋白

《Foods》：Purification of Protein Glutaminase by Cell Surface Display and Krill Protein Modification via Deamidation

　　

本研究采用一步细胞表面展示方法，成功纯化了一种源自Chryseobacterium lactis CGMCC 33780的新型蛋白质谷氨酰胺酶（CLPG），获得了其成熟形式。随后，研究人员表征了CLPG的酶学性质。该酶在pH 5和50°C的反应条件下表现出最佳活性，并在50°C孵育12小时后仍保留超过70%的活性。研究进一步探讨了CLPG介导的脱酰胺对磷虾蛋白分离物（KPI）结构和功能属性的影响。采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、圆二色光谱（CD）、差示扫描量热法（DSC）和扫描电子显微镜（SEM）等技术，对KPI的脱酰胺程度、构象变化和微观形态进行了综合分析。经CLPG脱酰胺处理后，KPI的起泡性和乳化性有所改变。当CLPG用量为1.0 U/g、对应脱酰胺度为15.18%时，KPI的乳化性达到最大值23%。这些性能提升可能主要归因于脱酰胺过程中诱导的静电斥力和疏水性增加。这项工作不仅为蛋白质谷氨酰胺酶的表达和纯化开创了新方法，还将其应用于磷虾蛋白的改性，为蛋白质谷氨酰胺酶的开发和应用提供了新见解。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
磷虾蛋白作为磷虾油提取过程中的副产物，富含优质氨基酸且生物价值高于传统肉类和乳蛋白，但因在中性和弱酸性条件下溶解度、乳化性和起泡性差，热稳定性不足，限制了其在食品工业中的高值化应用。蛋白质谷氨酰胺酶（Protein Glutaminase, PG）可催化谷氨酰胺残基脱酰胺为谷氨酸，改变蛋白质电荷分布和疏水性，从而改善功能特性。然而，现有PG酶（如源自Chryseobacterium proteolyticum的CPPG）对磷虾蛋白催化效率有限，且传统表达纯化需多步操作。因此，研究人员旨在开发一种高效PG酶并借助细胞表面展示技术简化纯化流程，进而评估其对磷虾蛋白分离物（Krill Protein Isolate, KPI）的修饰效果，为该副产物的功能提升和工业应用提供理论依据。

**研究内容与结论**
研究人员从Chryseobacterium lactis CGMCC 33780中克隆了新型蛋白质谷氨酰胺酶基因CLPG，利用源自大肠杆菌BL21(DE3)的脂蛋白（Lpp）和外膜蛋白A（ompA）融合标签，构建pET28a-Lpp-ompA-CLPG重组质粒并转化大肠杆菌。通过胰蛋白酶切割释放成熟CLPG，经一步Ni-NTA亲和层析纯化获得高纯度酶。CLPG在pH 5、50°C时活性最高，50°C孵育12h后残余活性>75%，在中性及弱碱性pH下稳定性良好；金属离子Mg²⁺、Ca²⁺等轻微促进活性，Fe³⁺、Cu²⁺抑制活性；动力学参数K_m=69.3 mM，V_max=111.5 U/mg，k_cat=228.2 min^-1。将不同剂量CLPG（0.1–3.0 U/g）与KPI反应1 h，脱酰胺度（DD）从0.1%升至21.7%，水解度（DH）均<0.7%，表明CLPG对谷氨酰胺基团高度专一。脱酰胺后KPI的浊度降低，表面疏水性增加（Bromophenol blue结合量从42.1 μg升至90.1 μg）。起泡能力从40.4%提升至73.1%，乳化活性指数（EAI）从21%增至23%（1.0 U/g时），但泡沫稳定性和乳液稳定性基本不变。粒径减小、Zeta电位绝对值增大，说明脱酰胺增强了静电斥力。FTIR显示主链结构未破坏但N–H/O–H峰红移；CD光谱表明α-螺旋含量下降、β-折叠和无规卷曲增加；内源荧光光谱红移提示色氨酸暴露；DSC显示变性温度先升后降（85.38°C→97.86°C→89.4°C）。SEM观察表明脱酰胺后KPI表面出现更多孔隙和裂纹，提示蛋白从聚集态向分散态转变。论文发表在《Foods》。

**关键技术方法**
主要方法包括：（1）细胞表面展示系统构建：将Lpp-ompA融合标签与CLPG基因克隆至pET28a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达；通过胰蛋白酶消化释放成熟CLPG，再经Ni-NTA亲和层析一步纯化。（2）酶学性质表征：测定最适pH、温度、pH稳定性、热稳定性、金属离子影响及动力学参数（Lineweaver–Burk法）。（3）脱酰胺修饰及性质分析：以不同酶底比处理KPI，测定脱酰胺度（DD，酚-次氯酸盐比色法）和水解度（DH，OPA法）。（4）结构与功能分析：采用FTIR、CD、DSC、SEM分析二级结构、热稳定性和微观形貌；测定浊度、表面疏水性（Bromophenol blue结合法）、起泡性、乳化性（EAI/ESI）、粒径及Zeta电位（Malvern Zetasizer）。

**研究结果**
**3.1 CLPG的生物信息学与结构分析**
通过序列比对和AlphaFold3建模，CLPG含有298个氨基酸，其中1–114为前肽，115–298为成熟肽，催化三联体为C156-H197-D217，前肽在活化前遮蔽活性口袋。

**3.2 CLPG的表达与纯化**
利用Lpp-ompA融合标签将CLPG展示于细胞膜表面，经胰蛋白酶切割后一步Ni-NTA纯化即获得纯度高的成熟CLPG（约17 kDa），相比传统胞内表达省去细胞裂解和二次纯化步骤，显著缩短流程。

**3.3 CLPG的操作与催化参数**
CLPG最适pH 5、最适温度50°C；pH 4–10范围内残余活性>50%；50°C下12h后残余活性约75%；30°C下12h后残余约90%。Mg²⁺、Ca²⁺、Li⁺、Ni²⁺、Ba²⁺轻微激活，Fe³⁺、Cu²⁺抑制。K_m=69.3 mM，V_max=111.5 U/mg，k_cat=228.2 min^-1，k_cat/K_m=3.3 min^-1·mM^-1。

**3.4 CLPG介导的KPI修饰**
**3.4.1 DD与DH**：DD随酶剂量递增（0.1%→21.7%），所有样品DH<0.7%，验证酶的高特异性。
**3.4.2 浊度与表面疏水性**：浊度从2.2降至1.8，表面疏水结合量从42.1 μg增至90.1 μg（↑114%），归因于羧基引入增强亲水性和疏水区域暴露。
**3.4.3 起泡与乳化性质变化**：起泡能力从40.4%升至73.1%，因疏水性增加促进界面吸附；但泡沫稳定性未变。EAI从21%升至23%（1.0 U/g时），升幅较小；乳液稳定性不变，因过多负电荷妨碍紧密分子堆积。

**3.5 CLPG调控的KPI功能性质**
**3.5.1 粒径与Zeta电位**：粒径随DD增加而减小，Zeta电位绝对值增大，表明静电斥力增强阻止聚集。
**3.5.2 FTIR与二级结构**：FTIR显示主链未变，N–H/O–H峰红移，Amide I带先红后蓝移；CD显示α-螺旋减少，β-折叠和无规卷曲增加。
**3.5.3 荧光光谱与热稳定性**：内源荧光红移提示色氨酸暴露；DSC显示变性温度先升至97.86°C后降至89.4°C，低剂量时形成稳定β-折叠网络，高剂量时过度静电斥力导致松散构象。
**3.5.4 表面形貌**：SEM显示随DD增加，KPI表面孔隙和裂纹增多，从聚集态转为分散态。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究聚焦于酶制备和初步修饰效果，尚未建立定量构效关系，未评估流变特性、消化率和生物利用度，且仅在实验室体系验证，缺乏真实食品基质验证。未来工作将建立结构-功能定量关联，补充流变与消化评价，开展食品基质验证，并利用分子模拟阐明酶修饰机制。
结论部分翻译：本研究表明，源自Chryseobacterium lactis CGMCC 33780的新型蛋白质谷氨酰胺酶CLPG可通过一步细胞表面展示方法纯化。与传统大肠杆菌表达方案相比，该方法省去一次纯化和超滤步骤，显著缩短实验时间。其对磷虾蛋白的脱酰胺作用有效调控了蛋白质的结构和功能特性。具体而言，脱酰胺南极磷虾蛋白的溶解度、起泡能力（提升80.9%）和乳化能力均得到增强。这些改善主要归因于脱酰胺后疏水区域的适当暴露和静电相互作用的改变。FTIR、CD和DSC分析进一步证实了上述发现。这项工作不仅为蛋白质谷氨酰胺酶的表达和纯化提供了新方法，也凸显了酶促脱酰胺作为一种高效蛋白质修饰策略的价值。脱酰胺磷虾蛋白性能的提升显著增强了其实用价值。虽然本研究初步证明CLPG催化脱酰胺可对蛋白质进行结构和功能修饰，但精确脱酰胺位点及脱酰胺蛋白亚基间的相互作用机制仍未解决，未来研究将聚焦于阐明这些机制。