湖南省低水活度食品中克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）的污染率、全基因组特征及传播模式

《Microorganisms》：Prevalence, Genomic Characterization, and Transmission Patterns of Cronobacter spp. in Low-Water-Activity Foods from Hunan Province, China

　　

摘要：克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）是机会性食源性病原菌，可致新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎及败血症。研究人员对湖南省562份低水活度食品（water activity, aw< 0.85）样本进行了系统性污染调查及全基因组流行病学分析。结果显示，克罗诺杆菌属总检出率为41.99%（236/562），其中香辛料污染率最高（60.06%），且高水平污染样本（>110 MPN/g）集中于此类别。236株分离菌包含6个种、120个序列型（Sequence Type, ST）及39个克隆复合体（Clonal Complex, CC），以阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）为优势种（64.83%），高危克隆ST4、ST1、ST148及ST64流行。检出多种毒力基因（TraJ、fur、rcsAB、rpoS）与耐药基因（qnrS1、blaTEM-1、blaCTX-M-55、blaLAP-2、aac(3)-IId、aadA2、tet(A)、floR、mcr-9.1、sul2）。核心基因组多位点序列分型（core genome Multilocus Sequence Typing, cgMLST）识别出两种聚类模式：C簇遗传聚类与不同品牌及省份间潜在共同上游原料相关的传播相符；G簇聚类提示同品牌多批次产品中可能存在生产环境持久定植。本研究阐明了湖南省低水活度食品中克罗诺杆菌属污染特征，为基于全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）的主动监测及供应链溯源提供依据。

论文解读：《Prevalence, Genomic Characterization, and Transmission Patterns of Cronobacter spp. in Low-Water-Activity Foods from Hunan Province, China》发表于《Microorganisms》

克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）隶属于肠杆菌科，为一群兼性厌氧革兰氏阴性机会性病原菌，其中阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）可致免疫力低下人群特别是新生儿引发脑膜炎、坏死性小肠结肠炎及败血症，病死率高达40%–80%。该菌具有极强的抗逆性，能在酸性、高渗及极低水活度（a_w< 0.6）环境中长期存活，因而广泛污染奶粉、香辛料、谷物制品等低水活度食品（Low-Water-Activity Foods, LWAFs）。尽管既往有散在报道，但针对我国特定区域LWAFs中克罗诺杆菌属的系统流行病学调查、全基因组耐药与毒力谱解析，以及基于核心基因组多位点序列分型（cgMLST）的传播链追溯仍较缺乏。湖南省饮食结构中香辛料及药食同源制品消费量大，明确其污染状况及分子流行病学特征对食品安全风险预警具有重要意义。为此，研究人员系统采集湖南省11个地市562份LWAFs样本（香辛料、药食同源食品、婴幼儿谷类辅助食品），通过分离鉴定、药敏试验及全基因组测序（WGS），结合cgMLST聚类与流行病学信息，阐明其污染水平、种系分布、毒力/耐药基因型及潜在传播模式，为供应链溯源及精准防控提供科学依据。

研究人员采用的关键技术方法如下：于2023–2024年按国家食品安全风险监测计划从湖南省11个地级市农贸市场、超市、网店采集562份LWAFs样本（338份香辛料、110份药食同源食品、114份婴幼儿谷类辅助食品）；依据GB 4789.40进行克罗诺杆菌属定性检测与最大可能数（Most Probable Number, MPN）定量，经显色培养基初筛及VITEK 2全自动微生物鉴定系统确认；采用 broth microdilution法行23种抗菌药物敏感性试验并按CLSI/FDA/EUCAST折点判读，耐≥3类抗菌药定义为多重耐药（Multidrug-Resistant, MDR）；提取细菌基因组DNA行Illumina NovaSeq 6000平台150 bp双端测序，Clean reads用SPAdes组装；通过PubMLST数据库行多位点序列分型（MLST），比对毒力因子数据库（VFDB）及综合抗生素耐药基因数据库（CARD）注释毒力与耐药基因；利用Panaroo构建泛基因组获取核心基因集，IQ-TREE构建最大似然进化树；针对优势种C. sakazakii行cgMLST分析并以≤10个等位基因差异定义基因组簇，结合采样时空及产品信息划分为共同来源支持簇（C簇）与单纯基因组簇（G簇）。

3.1. Isolation and Prevalence of Cronobacter spp.

对562份样本进行检测，总体克罗诺杆菌属检出率为41.99%（236/562）。各类别检出率分别为香辛料60.06%（203/338）、药食同源食品13.64%（15/110）、婴幼儿谷类辅助食品15.79%（18/114）。236份阳性样本中68.22%污染水平低于10 MPN/g，16.10%超过110 MPN/g；38份高水平污染样本中36份为香辛料（胡椒、孜然、辣椒等），表明香辛料不仅检出率高且存在严重污染。

3.2. Species Distribution and Dominant Clonal Lineages of Cronobacter spp.

236株分离菌经MLST鉴定为6个种：C. sakazakii占64.83%（153株），其次为C. malonaticus（14.83%）、C. turicensis（8.47%）、C. muytjensii（5.93%）、C. dublinensis（4.23%）及C. universalis（1.69%）。共检出120个ST、39个CC；C. sakazakii遗传多样性最高（61个ST、25个CC），优势克隆为ST4（n=13）、ST1（n=12）、ST148（n=11）、ST64（n=11），对应CC4、CC1、CC16、CC64，且主要源自香辛料。

3.3. Virulence Gene Profiles and Key Determinants

所有分离菌均携带VI型分泌系统-II（T6SS-II）、荚膜合成基因、周生鞭毛基因及全局调控基因fur和rcsAB，rpoS检出率99.58%；TraJ（接合转移调控蛋白）检出率2.12%，Sfp菌毛基因4.24%。结果表明克罗诺杆菌属具备黏附、免疫逃逸、干燥耐受及毒力质粒水平传播潜力。

3.4. Antimicrobial Resistance Phenotypes and Their Genetic Determinants

236株菌对碳青霉烯类、第三/四代头孢菌素及β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合100%敏感；仅5株（2.12%）为MDR。第一、二代头孢菌素（如cefazolin）呈现高耐药/中介率，归因于染色体编码AmpC型β-内酰胺酶（bla_CSA/bla_CMA）固有耐药。检出qnrS1（1.27%）、bla_CTX-M-55（0.42%）、bla_TEM-1（0.42%）、tet(A)（0.42%）、floR（0.84%）、mcr-9.1（3.81%）、sul2（0.84%）等获得性耐药基因；mcr-9.1检出率高于多黏菌素E表型耐药率（2.54%），提示基因沉默或低水平表达。

3.5. Phylogenetic Relationships of Cronobacter spp. Isolates Based on Core Genome Analysis

基于核心基因组构建的最大似然进化树将236株菌明显聚为6个种特异性分支，与MLST种鉴定结果一致，C. sakazakii形成最大单系群（153株），印证MLST分型可靠性。

3.6. Genomic Epidemiology and Transmission Patterns

对153株C. sakazakii行cgMLST鉴定出4个基因组簇：C1–C3为共同来源支持簇（不同地点/时间/品牌但≤2个等位基因差异，提示共享上游原料或代加工厂污染），G1为同品牌不同批次高相似度菌株（2个等位基因差异，间隔12天采样、38天生产日期差，提示生产环境持久定植）。毒力与耐药基因在各簇中呈散在分布，无显著谱系富集。

讨论与结论总结

讨论指出，湖南省LWAFs特别是香辛料中克罗诺杆菌属高污染率高于国内外部分地区报道，高危克隆ST4（关联新生儿脑膜炎）、ST1（婴儿呼吸道感染）、ST148（老年免疫缺陷者感染）及ST64广泛存在，需针对性防控。毒力基因谱显示T6SS-II及干燥耐受调控基因rpoS普遍携带，增强环境适应与致病潜能。药敏表型整体敏感，但需注意染色体AmpC介导的一/二代头孢菌素固有耐药及mcr-9.1隐性传播风险；氟苯尼考中介率高可能与染色体多重耐药外排泵过表达有关。cgMLST揭示两类传播线索——跨品牌C簇提示上游原料或共用设施污染源，需跨区域供应链溯源；同品牌G簇提示生产环境持久定植，需强化环境涂抹及清洗消毒验证，传统成品批检不足以发现此类风险。

结论（翻译）：

研究人员通过对湖南省低水活度食品克罗诺杆菌属系统性WGS分析揭示了其分布模式、遗传多样性及耐药毒力特征。克罗诺杆菌属总检出率41.99%，香辛料污染最严重（60.06%）且为主要高水平污染（>110 MPN/g）来源；C. sakazakii为优势种（64.83%），全球高危临床克隆ST4、ST1、ST148、ST64广泛流行。分离株对碳青霉烯类及第三/四代头孢菌素100%敏感，MDR率仅2.12%；检出qnrS1、bla_TEM-1、bla_CTX-M-55、bla_LAP-2、aac(3)-IId、aadA2、tet(A)、floR、mcr-9.1、sul2等耐药基因，mcr-9.1检出率（3.81%）高于表型耐药率，提示隐蔽传播风险。毒力基因（TraJ、fur、rcsAB、rpoS）覆盖黏附、效应物递送、免疫逃避及全局调控，赋予强致病潜能与环境适应性。cgMLST识别两种需差异化干预的聚类模式：C簇（跨品牌/跨省高遗传相似）提示上游原料或供应链共同来源，建议开展跨区域溯源；G簇（同品牌跨批次高遗传相似）提示生产环境可能存在持久定植，建议加强针对性环境监测、分区采样及清洗消毒效果验证。本研究为湖南省低水活度食品中克罗诺杆菌属精准风险评估提供了较全面的基因组流行病学基线，并为实施基于WGS的常规监测及供应链溯源机制奠定科学基础。