《Food Bioscience》：Pig spleen ferritin functions as a high-capacity nanocarrier: Structural and functional insights
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Meng Cai|Yilang Liu|Yaoyu Zhu|Chenyan Lv|Jiachen Zang|Guanghua Zhao|Tuo Zhang中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083，中国摘要铁蛋白是一种能够氧化铁并储存铁的蛋白质，几乎存在于所有生命形式中
Meng Cai|Yilang Liu|Yaoyu Zhu|Chenyan Lv|Jiachen Zang|Guanghua Zhao|Tuo Zhang
中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083，中国
摘要
铁蛋白是一种能够氧化铁并储存铁的蛋白质，几乎存在于所有生命形式中。由于其独特的笼状结构以及出色的生物相容性，铁蛋白被用作递送生物活性物质、进行体内成像以及设计纳米反应器的平台，可通过其内部空腔包裹功能性物质。为了利用屠宰副产品，本研究首次分离并全面分析了天然猪脾铁蛋白（PSFt）的特性。通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳、动态光散射和透射电子显微镜分析，确认PSFt具有典型的24聚体笼状结构，其水动力半径约为8.47纳米，大于其他哺乳动物铁蛋白的数值。对PSFt进行硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，仅出现一个亚基条带，该条带被鉴定为猪铁蛋白轻链。动力学实验表明，重组PSFt的铁氧化速率明显快于人类L链铁蛋白，而铁释放速率则更慢。X射线晶体学和结构分析显示，PSFt的内部空腔更大，更适于装载物质，这一特性通过姜黄素封装实验得到了验证。通过将人类重链铁蛋白的3重通道和4重通道的入口残基替换为与PSFt对应的残基，HuHF的装载能力提高了3.25倍。综上所述，这些结构和功能特性表明PSFt是一种很有前景的纳米载体，也可作为设计其他铁蛋白笼状结构的模板。
引言
畜禽加工业是食品工业的重要组成部分，它不仅提供大量高质量蛋白质，还会产生大量的屠宰副产品——如内脏、血液、骨头、毛发等——而这些副产品的开发价值至今尚未得到充分挖掘（Borrajo等人，2019年）。根据最新统计数据，欧盟每年有近3.3亿只动物被屠宰，产生的屠宰副产品量高达每年2000万吨左右（Y. Fu等人，2019年；Toldrá等人，2021年；Toldrà等人，2019年）。联合国粮食及农业组织的数据表明，仅屠宰副产品就占食物浪费总量的一半以上，这说明这些材料并未得到充分利用，既造成了资源损失，也带来了环境压力（Babatunde等人，2017年；Borrajo等人，2019年；Y. Fu等人，2019年）。动物脾脏是一种常见的屠宰副产品，其中所含的蛋白质、脂类和矿物质（尤其是血红素铁和其他生物活性成分）具有潜在的营养和生物医学价值（Al-Zohairi等人，2023年；Jayathilakan等人，2012年）。在各种被屠宰的动物中，猪脾脏因其较大的屠宰量和较高的功能性蛋白质含量而更具开发利用价值。在欧盟和中国等地，养猪业在畜牧业中占据主导地位，对农业经济有着重要影响（Al-Zohairi等人，2023年）。新鲜猪脾脏中含有约17%–18%的高质量蛋白质；然而，尽管成分良好，但由于其感官品质较差以及其他实际限制，这种器官的用途仍然十分有限。因此，脾脏常常在屠宰场被丢弃，造成了本可避免的蛋白质资源损失（López-Pedrouso等人，2023年；Seong等人，2014年）。合理利用畜禽副产品是推动可持续农业和食品工业发展的关键策略。因此，将低价值的动物副产品作为功能性蛋白质的来源这一研究方向受到了广泛关注，也成为应用研究的重点（Boles等人，2000年；Darine等人，2011年；Y. Fu等人，2019年；Jayathilakan等人，2012年；Lynch等人，2018年）。
铁蛋白是一种高度对称且稳定的含铁蛋白质，1937年由Victor Laufberger首次从马脾脏中分离出来（Laufverger，1937年）。由于具有能够储存大量铁的空心内部结构，铁蛋白可作为储铁蛋白发挥作用（Ford等人，1984年；Theil，2004年）。在动物体内，铁蛋白在代谢活跃的组织中含量丰富，如脾脏、肝脏、骨髓、大脑和血清中都有存在（Harrison & Arosio，1996年）。哺乳动物的铁蛋白通常是异聚体，由H型（重链）亚基（约21 kDa）和L型（轻链）亚基（约19 kDa）组成，这两种亚基的氨基酸序列相似度约为55%；不同组织类型的H:L比例有所不同（X. K. Yang等人，1998年）。代谢活动较强的器官（如心脏、大脑）主要表达H亚基，而负责储铁的器官（如脾脏、肝脏）则富含L亚基。这两种亚基共同作用以维持体内的铁平衡。不过，线粒体铁蛋白和核铁蛋白被确定为仅由H链亚基构成的同聚体（Ciambellotti等人，2021年；Surguladze等人，2005年）。传统铁蛋白的三维结构具有高度保守性：它是由12个反平行二聚体构成的24聚体空心纳米笼，这些二聚体通过非共价相互作用组装成近乎规则的八面体结构，其分子量约为450–500 kDa。24个亚基的4-3-2对称性形成了三种类型的通道——6个4重通道、8个3重通道和12个2重通道——这些通道负责铁元素和小分子在笼子内的传输，也是其与外界进行物质交换的主要途径（Crichton & Declercq，2010年；Mohanty等人，2022年；Theil等人，2013年）。凭借其笼状结构以及天然的生物相容性，铁蛋白已被应用于多种领域，包括重金属检测（Lv等人，2020年；Y. J. Wang等人，2019年）、药物递送（Liang等人，2014年；Monti等人，2017年；Petruk等人，2019年）、体内成像（Z. T. Wang等人，2016年）、纳米载体制造（L. L. Chen等人，2014年；T. Zhang等人，2014年；Zhou等人，2017年）以及纳米反应器设计（H. Chen等人，2021年；Zeng等人，2024年）。这些应用大多利用了铁蛋白内部空腔可以包裹功能性物质的特点。
鉴于铁蛋白出色的功能特性和生物活性，来自不同物种的铁蛋白已经被大量纯化并进行了深入研究。如果能够分离并研究猪脾铁蛋白（PSFt）的特性，不仅可以提高食品工业中蛋白质资源的利用率，还能通过减少浪费和污染来助力循环经济目标的实现。然而截至目前，尚未有关于PSFt的晶体结构及其全面功能特性的研究报告。在本研究中，我们建立了PSFt的纯化方法，并通过X射线晶体学技术以2.31埃的分辨率解析出了其结构。研究表明，天然PSFt由24个亚基构成笼状结构，这些亚基主要以L链为主。通过铁氧化沉积实验展示了PSFt的生理特性。基于PSFt与人类H链铁蛋白（HuHF）的序列和结构比对，我们制备了HuHF-34ch突变体，该突变体的3重通道和4重通道的入口处被替换为与PSFt对应的残基。姜黄素封装实验及结构分析结果表明，我们成功设计出了一种具有高装载能力的纳米载体。突变体设计进一步证实了PSFt具有高装载能力这一结论，同时也为设计其他类型的铁蛋白笼状结构提供了参考。总体而言，这项研究通过深入理解PSFt的结构与功能关系，利用屠宰副产品开发出了高容量的铁蛋白纳米载体。
章节节选
化学试剂
三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、β-巯基乙醇、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺以及考马斯亮蓝R-250均购自中国上海的Sigma-Aldrich Chemical Co.。质粒pET3a以及宿主菌株大肠杆菌BL21（DE3）则保存在我们的实验室中。异丙基-β-D-硫半乳糖苷（IPTG）和氨苄西林则从Sigma公司购买，纯度约为99%。姜黄素则纯度超过98%。
PSFt的纯化与特性分析
通过硫酸铵沉淀法结合凝胶过滤色谱法，从新鲜猪脾脏中纯化了PSFt。从100克新鲜猪脾脏组织中，共纯化了约150毫克的PSFt，纯化收率为0.15%。凝胶过滤实验结果显示，纯化的PSFt为单分散物质，其表观分子量为480,103 ± 975道尔顿（n=3）（见图1a）。SDS-PAGE实验显示在约20.1 kDa处出现一个单一亚基条带（见图1b，S1），而天然聚丙烯酰胺凝胶电泳则表明PSFt表现为单一的均匀物质，这一结果与之前的研究一致。
结论
本研究成功分离并全面分析了天然PSFt的特性，揭示了其独特的结构与功能特点。PSFt具有典型的24聚体铁蛋白结构，主要由L链亚基组成，其水动力半径为8.47纳米，这一数值大于其他已报道的哺乳动物铁蛋白的数值。与HuLF相比，rPSFt-L的铁氧化速率更快，这也解释了PSFt具备相应生物活性的原因。值得注意的是，X射线晶体学和动态光散射实验都证实了PSFt的尺寸确实更大。
CRediT作者贡献说明
Meng Cai：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，方法学，研究，数据整理，概念构建。Yilang Liu：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，方法学，研究，正式分析，数据整理，概念构建。Yaoyu Zhu：写作——审阅与编辑，可视化，验证，方法学，正式分析，数据整理。Chenyan Lv：写作——审阅与编辑，资源获取，项目管理。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2023YFF1103800）以及中国农业大学2115人才发展计划的支持。同时，特别感谢上海同步辐射设施为本研究提供的辐照时间。此外，也感谢上海国家蛋白质科学中心BL17U1/BL18U1光束线的工作人员在数据收集过程中给予的帮助。
