酱香型大曲(Daqu)两个香气等级理化性质、微生物组及风味特征的综合分析鉴别研究

《Food Chemistry: X》：Integrated analysis of physicochemical properties, microbiome, and flavor profiles for differentiating two aroma grades of sauce-flavor Daqu

　　

摘要：香气特征是评价酱香型大曲(Daqu)质量的关键指标。本研究系统比较了一级香气大曲(GF)与二级香气大曲(GS)的理化性质、酶活性、微生物组及风味谱。GF具有较高总酸度、氨基氮含量、酸性蛋白酶(acid protease)活性及较低pH值，并与潜在关联风味前体合成的细菌富集相关，如广州科彭斯泰特菌(Kroppenstedtia guangzhouensis)和象牙色科彭斯泰特菌(Kroppenstedtia eburnea)；GS显示较高的液化酶/纤维素酶活性及pH值，并与水解真菌如宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)及关联异嗅味的海芽孢杆菌属(Oceanobacillus)优势定植相关。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC–MS)结合变量重要性投影(VIP)及气味活度值(OAV)分析鉴定出11种差异挥发性化合物。醛类物质与正向香气等级呈强相关，可作为潜在等级区分标志物；而GS积累与异嗅味相关的二甲基三硫醚(dimethyl trisulfide)。研究结果揭示了大曲多组学特征与香气等级分化的内在关系，为酱香型大曲质量评价与生产调控提供理论支撑。

酱香型大曲(Daqu)两个香气等级理化性质、微生物组及风味特征的综合分析鉴别研究——论文解读

本文发表于《Food Chemistry: X》。酱香型白酒是中国四大香型之一，其独特风味主要源自高温大曲(Daqu)中复杂的微生物代谢与酶催化作用。大曲占酱香型白酒发酵糟醅比例可达50%，其质量直接决定成品酒的风味与等级。在实际生产中，大曲常依据感官香气特征分为不同等级，但目前大曲质量评价主要依赖主观性较强的感官评定及简单理化分析，缺乏客观的分子标记物辅助量化；且已有研究多关注大曲颜色或培菌温度导致的分类差异，针对同一工艺下因实际感官香气优劣形成的等级差异及其背后微生物—代谢机制的研究尚为空白。为此，研究人员以茅台镇同一批次、同工艺生产的酱香型大曲为对象，按专家感官评审分为一级香气大曲(GF，具典型酱香、豆豉香及焙烤香)与二级香气大曲(GS，具霉味、氨味、酸败等异嗅)，整合宏基因组测序(metagenomic sequencing)、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC–MS)及理化和酶活性测定，系统解析两等级大曲微生物群落结构、功能潜能及挥发性化合物差异，筛选与香气等级关联的关键微生物类群与风味标志物，揭示大曲香气等级分化的微生物—代谢关联机制，为大曲标准化质量评价与生产调控提供理论基础。

主要关键技术方法

研究人员自贵州茅台镇某酱香型白酒企业同一批次、相同45天发酵周期的大曲中，经16人专家感官评审panel按香气特征（非外观）划分一级大曲(GF, n=10)与二级大曲(GS, n=10)，四分法取样。主要技术方法包括：(1) 常规理化指标(pH、水分、总酸、氨基氮、淀粉、还原糖)及酶活性(糖化酶、液化酶、酯化酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶)测定，参照QB/T 4257-2011及文献改良DNS法；(2) 宏基因组测序(Illumina NovaSeq X Plus PE150)，Clean reads经Kaiju比对NCBI NR数据库进行物种注释，ORFs预测与非冗余基因集分别比对KEGG与CAZy数据库注释功能，α/β多样性及LEfSe分析鉴别等级特异性微生物类群；(3) 电子鼻(PEN3)检测整体香气响应；(4) HS-SPME-GC–MS检测挥发性化合物，经NIST 17库匹配及线性保留指数(LRI)验证定性，内标法定量，筛选VIP>1且p<0.05的差异挥发物并以标准曲线精确定量，计算气味活度值(OAV=C/OT，OT为水中阈值)评价呈香贡献；(5) Spearman相关与Mantel检验分析微生物—理化—挥发性化合物关联。

研究结果

3.1. 理化与酶活性特征(Physicochemical and enzyme activity characteristics)

经Wilcoxon秩和检验，GS pH显著升高(p=0.000004)，GF总酸度(p=0.003)与氨基氮(p=0.006)显著更高；水分、还原糖、淀粉无显著差异。酶活性方面GS液化酶(p=0.000057)与纤维素酶(p=0.004)极显著偏高，GF酸性蛋白酶、酯化酶趋势偏高但未达显著。表明GF具备更利于Maillard反应与风味前体积累的生化基础，GS偏向大分子碳水化物过度水解。

3.2. 微生物组成(Microbial composition)

宏基因组注释到182门、4280属、18111种。细菌中厚壁菌门(Firmicutes)为优势门且在GS略高；真菌中子囊菌门(Ascomycota)在GF偏高。属水平GF富集克罗彭斯泰特菌属(Kroppenstedtia)、Desmospora、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)；GS富集曲霉属(Aspergillus)、拟青霉属(Paecilomyces)、溶酪霉属(Lichtheimia)。种水平GF显著富集Saccharopolyspora rectivirgula、Kroppenstedtia guangzhouensis、Kroppenstedtia eburnea、Desmospora sp. 8437；GS富集Paecilomyces variotii、Lichtheimia corymbifera、Aspergillus chevalieri。

3.3. 微生物多样性分析(Microbial diversity analysis)

GF α多样性(Shannon、Simpson指数)显著高于GS(p=0.021)，Chao1与ACE指数数值偏高但无显著差异。Bray-Curtis距离PCoA显示两组样品明显分离。LEfSe分析(LDA>3.5)确认GF标志类群含Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、放线菌纲(Actinomycetia)；GS标志类群含Aspergillus、Paecilomyces、毛霉门(Mucoromycota)。

3.4. 微生物KEGG功能分析(KEGG functional analysis of microbial)

KEGG Level 2以代谢相关基因为主（碳水化合物代谢、氨基酸代谢等）。PCoA显示两等级功能谱明显分开。GF富集代谢类别通路，尤辅酶/维生素代谢、氨基酸代谢、其他氨基酸代谢及赖氨酸降解；GS富集细胞过程类别，含亚油酸代谢、次级代谢产物生物合成等。

3.5. 碳水化合物活性酶(CAZy)注释(Annotations of carbohydrate-active enzymes, CAZy)

六大门类中糖苷水解酶(GH)与糖基转移酶(GT)最丰富。GF GH及CBM(碳水化合物结合模块)相对丰度更高，涵盖GH128、GH25、GH106等家族，暗示较强多糖降解产还原糖潜能；GS GT相对偏高，倾向多糖合成。CAZy PCoA显著分离，LEfSe示GF富集CBM50、GH2、GH73等32个家族，GS仅少数家族(CE8、GH17等)富集。

3.6. 风味分析(Flavor analysis)

感官评分GF于粮香、甜香、酱香维度高于GS，GS异嗅(off-flavor)评分显著高。电子鼻WC系列传感器GF响应更强，PCA可区分两组。HS-SPME-GC–MS检出58种挥发性物（酯12、醇13、酸1、醛10、酮6、吡嗪3等），共有高含量成分为苯乙醇、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯及四甲基吡嗪。OPLS-DA模型(R²Y=0.986, Q²=0.911)结合VIP>1、p<0.05及FC筛选得13种差异挥发物，其中11种OAV≥1具呈香贡献。GF特征高OAV化合物含支链及脂肪族醛(2-甲基丁醛、异戊醛、异丁醛、己醛)、1-壬醛、3-辛酮、壬酸乙酯及独有1-辛醇；GS高OAV化合物为芳樟醇、愈创木酚、二甲基三硫醚(DMTS, OAV≈112)及独有2-十一烷酮。醛类与优级香气正相关，DMTS关联异嗅。

3.7. 微生物—挥发性化合物—理化性质关联(Correlations among microorganisms, volatile compounds and physicochemical properties)

Mantel检验示细菌群落与pH、水分显著相关，真菌与酸度显著相关。Spearman热图示Kroppenstedtia与氨基氮正相关，Oceanobacillus与液化酶/纤维素酶及pH正相关，Saccharopolyspora与pH及液化酶负相关等。微生物—差异挥发物网络表明：Kroppenstedtia与支链醛(异丁醛、异戊醛、2-甲基丁醛)正相关，Rasamsonia与1-壬醛、己醛正相关，Oceanobacillus与DMTS、芳樟醇、愈创木酚正相关且与支链醇/醛负相关，Bacillus与支链醛/醇负相关。

讨论与结论总结

讨论部分指出，GF较高氨基氮与总酸为Maillard反应提供前体，关联Kroppenstedtia等菌蛋白酶活性促氨基酸积累，酸性环境利于功能微生物维持微生态稳定；GS高液化/纤维素酶源于水解真菌过度生长但不利优质大曲所需缓释放特性。微生物组成与互作复杂度（而非单纯丰度）是关键，GF富集功能菌促风味前体合成，GS Oceanobacillus等致异嗅硫化物累积。KEGG与CAZy功能分化体现GF偏向风味前体生成代谢(GH/CBM、氨基酸代谢)，GS偏向多糖合成(GT)。醛类为优级潜在标志物，DMTS关联降级异嗅。微生物—代谢关联中Kroppenstedtia可能经蛋白水解—Ehrlich途径促支链醛生成，Rasamsonia关联脂氧化裂解产C6/C9醛，Oceanobacillus具含硫氨基酸降解基因致DMTS累积。

结论(Conclusions)：本研究证实酱香型大曲GF与GS在理化(pH降低、总酸及氨基氮升高)、微生物(富集Kroppenstedtia、Saccharopolyspora等功能菌vs GS富集Aspergillus、Oceanobacillus等)及挥发性谱(GF富集合格醛类等OAV高的化合物，GS积累二甲基三硫醚)上存在系统性差异。筛选出11种具高OAV差异挥发物作为两等级潜在化学区分标志物。大曲香气等级分化密切关联理化属性变化、功能性微生物组装及代谢谱偏移，结果为理解大曲香气等级形成机制及大曲质量优化与工艺管理提供初步依据。