《Food Chemistry: X》：4,6-α-Glucanotransferase: An enzymatic biocatalyst for the modification of starch and starch-food systems
随着消费者对更健康、低热量食品及具有改善理化性质配料需求的增加，淀粉改性策略以提升其营养和技术功能性质的研究日益受到关注。在这些策略中，一种被称为4,6-α-葡聚糖转移酶（4,6-α-GTase）的淀粉转化酶的应用引起了相当大的关注。4,6-α-GTase发现于多种细菌来源，尤其在乳酸菌（LAB）中显著存在，其可将淀粉转化为多样的α-葡聚糖，具体产物取决于酶类型、底物特性和反应条件。产物包括线性α-(1,6)-连接葡萄糖单元，如异麦芽-麦芽寡多糖（IMMP），或具有交替α-(1,4)和α-(1,6)糖苷键的类Reuteran聚合物。这些结构修饰已被证明可提高缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）的比例，同时改善食品的理化性质和功能特性。本文综述了关于4,6-α-GTase的现有知识、其催化性质及其在食品体系中的潜在应用，为支持酶改性淀粉配料的进一步研究与开发提供见解。
**1. 引言**
碳水化合物被认为是人类食物和能量的主要来源。淀粉是世界上第二丰富的碳水化合物，以颗粒形式存在于绿叶的叶绿体和种子、豆类及块茎的淀粉体中。摄入后，淀粉消化始于口腔并持续至整个肠道，在唾液和胰脏α-淀粉酶的作用下被水解为麦芽寡糖，最终由刷状缘酶（包括α-葡萄糖苷酶）消化为葡萄糖，作为各种身体机能的主要能量来源。淀粉颗粒由直链淀粉（amylose）和支链淀粉（amylopectin）分子组成。直链淀粉具有线性α-(1,4)连接的葡萄糖单元，而支链淀粉是具有α-(1,4)连接和每20-25个葡萄糖残基出现α-(1,6)分支点的分支多糖。直链淀粉和支链淀粉共同贡献于淀粉分子的半结晶结构，在结晶区和无定形区之间交替排列。结晶区是平行支链淀粉的紧密堆积部分，而无定形区包括较无序的直链淀粉链和支链淀粉分支。淀粉颗粒的结晶度、形状、大小和形态影响淀粉分子的多种技术功能性质，包括其糊化、糊化特性曲线、回生性质及最终的消化性。在营养特性方面，淀粉根据其在体内消化和吸收过程中的葡萄糖释放速率分为快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）。RDS主要由无定形区组成，易于在十二指肠和小肠中消化和吸收；SDS含有不可接近的无定形区，在整个肠道中经历较慢的消化和吸收；RS不易被分解为葡萄糖，到达结肠后作为有益细菌的碳源，产生短链脂肪酸（SCFAs），如乙酸、丁酸和丙酸。过量和长期摄入RDS是导致肥胖、II型糖尿病、慢性心脏病和龋齿等各种健康问题的主要因素之一。最有效的慢性病预防方法之一是饮食调控，消费者正积极寻求注重健康的饮食选择和促进健康的功能性食品，这一趋势使缓慢消化和抗性碳水化合物受到关注，因为它们可被配制为具有低血糖指数（GI）值并提供益生元益处的产品。在技术功能性质方面，天然淀粉的某些特性使其在多种食品工业应用中不尽理想，如作为包埋剂、增稠剂、可食用涂层和凝胶剂。例如，淀粉具有高回生性、低剪切性、水分散性差以及糊化后高粘度等问题。因此，改善淀粉的营养和技术功能性质需要关注其分子修饰，重点在于改变直链淀粉和支链淀粉含量、链长、分支点和新型糖苷键的形成。物理、化学和酶法方法被用于淀粉修饰以增强其理化、技术功能和营养性质（RS和SDS含量）。尽管物理和化学方法具有多样化应用和益处，但若干缺点阻碍了其高效应用。传统物理方法反应时间长，新型物理方法昂贵、复杂且一致性有限；化学改性技术耗时、消费者接受度负面，且可能被认为对环境有害。相比之下，酶的高选择性和特异性可产生环境友好的改性过程，产生较少的不需要的化合物，得到纯净、高品质和天然的产品。
**2. 4,6-α-葡聚糖转移酶催化的淀粉修饰**
4,6-α-葡聚糖转移酶（4,6-α-GTases，EC 2.4.1.-）是糖苷水解酶家族70（GH70）的淀粉活性成员，也是葡聚糖蔗糖酶（glucansucrases）的亚家族。葡聚糖蔗糖酶以蔗糖为底物，产生多种α-葡聚糖，主要包括以α-(1,6)键为主的葡聚糖（dextran）、以α-(1,3)键为主的变聚糖（mutan）、具有α-(1,4)和α-(1,6)键的Reuteran，以及具有交替α-(1,3)/α-(1,6)键的交替聚糖（alternan）。相比之下，4,6-α-GTase作用于淀粉和淀粉水解产物，通过切割α-(1,4)键并将葡萄糖基单元转移至受体分子。这种转糖基反应引入新的α-(1,6)键，可位于线性葡聚糖片段内部或分支点，产生结构多样的淀粉衍生终产物。4,6-α-GTase的功能多样性主要受活性位点结构、环长度、供体和受体亚位点可及性以及底物结合差异的调控。这些结构特征决定酶是否倾向于α-(1,6)键形成、α-(1,4)转糖基化、水解、进行性链延长或短麦芽寡糖单元转移。因此，酶的结构直接影响改性碳水化合物的连接模式、分子大小、分支分布和链长。目前已鉴定的第一个4,6-α-GTase亚家族称为GtfB，主要在乳酸菌（LAB）中发现。随后，GtfC和GtfD亚家族被发现，分别主要存在于革兰氏阳性（非LAB）和革兰氏阴性细菌中。这些亚家族在结构和氨基酸序列上存在差异，影响底物特异性和终产物谱。晶体结构和系统发育研究表明，4,6-α-GTase淀粉转化酶是GH13淀粉作用淀粉酶和GH70葡聚糖蔗糖酶之间的进化中间体，这从GH13、GH70和GH77（GH-H酶家族的成员）在结构和催化机制上的相似性得以体现。这种进化转变可能始于人类饮食的变化，特别是当蔗糖等简单糖类开始替代淀粉等复杂碳水化合物时。4,6-α-GTase与葡聚糖蔗糖酶和GH13淀粉酶类似，含有A/B/C核心结构域，其中结构域A具有(β/α)
8桶状拓扑结构。然而，与GH13酶不同，葡聚糖蔗糖酶和4,6-α-GTase具有额外的结构域IV。葡聚糖蔗糖酶和GtfB酶还具有一个额外的结构域V，其功能尚未完全阐明。此外，GtfC和GtfD与GH13和GH77酶类似，具有非置换的结构域组织，而GtfB和葡聚糖蔗糖酶经历了核心结构的环状置换，保守序列基序的顺序呈U型折叠，依次为II、III、IV和I。
**2.1 4,6-α-葡聚糖转移酶的反应机制**
4,6-α-GTase活性的反应机制尚未完全阐明。研究人员提出了Lr121 GtfB-ΔN反应的以下机制，涉及几个关键步骤。首先，供体底物结合至活性切割位点，供体亚位点的亲和力高于受体亚位点，导致其被占据，这可能与A1和B环形成的隧道样结构有关。随后，底物通过广义酸/碱残基谷氨酸在+1和?1亚位点之间的切割位点进行切割。接着，催化亲核试剂攻击?1亚位点葡萄糖单元的碳1（C1），形成共价糖基-酶中间体。随后可能发生两种途径：水解（在水分子存在下）或转糖基化（在另一个合适的糖分子存在时）。在水解反应中，水分子攻击共价中间体的C1，导致葡萄糖释放；在转糖基化过程中，糖受体攻击中间体，形成新的糖苷键。因此，受体分子的取向是形成α-(1,4)、α-(1,6)甚至α-(1,3)键的关键决定因素。一旦形成α-(1,6)键，混合IMMP可以从活性位点扩散或沿隧道样结构移动。在某些情况下，新形成的转糖基化产物不会立即释放，而是保留结合在隧道样区域中，允许另一轮转糖基化而不完全解离，这种现象称为进行性催化（processive catalysis）。底物结构也强烈影响反应结果，例如Lr121 GtfB-ΔN以直链淀粉为底物时表现出更大的α-(1,6)键形成催化能力，可达约80%的α-(1,6)键，而以支链淀粉为底物时，产生α-(1,6)键的能力降低至约14%。
**2.2 4,6-α-葡聚糖转移酶的反应特异性**
4,6-α-GTase产生多种淀粉衍生碳水化合物，包括IMMP、IMMO、类Reuteran α-葡聚糖，以及极少数情况下的含α-(1,3)键葡聚糖。这种多样性反映了酶亚家族、活性位点结构、底物类型、链长和反应条件的差异。GtfB酶倾向于生成具有进行性α-(1,6)键形成的IMMP，而GtfC倾向于产生较短的IMMO类型产物，GtfD则与更多分支类型的终产物相关。GtfC亚家族在产品形成特性上显示出差异，一些GtfC样酶具有额外的C末端结构域，含有细菌Ig2样折叠，功能未知，且缺乏GtfB酶中先前看到的N末端和结构域V。GtfD的赖氨酸残基被组氨酸取代，可能有助于减少聚合物形成；天冬酰胺和天冬氨酸残基可能阻断?1以外的活性亚位点，从而限制较长寡糖作为底物的可及性，导致每个反应循环转移单个葡萄糖单元，因此GtfD酶倾向于产生更多分支产物。
**2.3 4,6-α-葡聚糖转移酶的催化特性**
4,6-α-GTase的催化特性因酶来源、亚家族、结构特征和反应条件而异。一般而言，LAB来源的4,6-α-GTase在弱酸性和中温至中等嗜热条件下表现出最佳pH活性，与其来源生物的生理环境一致。大多数LAB来源的4,6-α-GTase的最佳pH值范围为4.0-6.0，最佳温度在30-50°C之间。非LAB来源的4,6-α-GTase，特别是大多数GtfC和GtfD酶，展现出更广泛的催化特性。为提高4,6-α-GTase的热稳定性，已探索多种策略，包括筛选天然耐热酶、优化反应条件以及工程化蛋白质的柔性区域。例如，引入脯氨酸残基到柔性环区以固化极性残基，减少环呼吸运动，使突变体活性提高2.08倍，最适温度提高5°C，酶熔解温度提高5.76°C，半衰期比野生型延长11.95倍。高底物浓度可能通过促进底物结合和稳定活性构象来保护酶免受热失活。
**3. 4,6-α-葡聚糖转移酶的功能特性和应用**
4,6-α-GTase的营养特性在于其能够将淀粉和淀粉衍生底物的结构修饰为具有增强发酵性和益生元潜力的低热量产品。这些结构变化主要是由于将α-(1,6)键引入淀粉衍生α-葡聚糖中。根据细菌酶来源、底物类型、酶和反应条件，4,6-α-GTase改性碳水化合物中α-(1,6)键的比例变化很大，从低至7%到高达90%不等。α-(1,6)键邻近α-(1,4)区域的形成可以限制消化性α-淀粉酶对线性淀粉片段的可及性，因此大多数4,6-α-GTase处理的碳水化合物预计表现出较低的消化性（较低的RDS，较高的SDS和RS含量）。IMMP等4,6-α-GTase处理碳水化合物的益生元潜力源于其在小肠中消化抗性的增加，以及随后作为碳源增加肠道菌群（如乳杆菌、拟杆菌和双歧杆菌）生长和多样性的可用性。体内研究表明，IMMP与盲肠和结肠微生物群的变化相关，而在回肠中观察到的变化有限，表明IMMP主要在下肠道发酵。IMMP还具有免疫调节作用，可通过激活TLR2、TLR4和NF-κB信号通路以及刺激细胞因子产生来减少抗生素需求并增强免疫刺激。
**4. 4,6-α-GTase终产品的技术功能特性**
除营养特性外，4,6-α-GTase改性淀粉在食品系统应用中也受到极大关注，因为酶法改性可影响淀粉回生、流变学、质地和储存稳定性。现有研究主要集中于小麦、马铃薯、玉米和蜡质淀粉及其在面包和无麸质配方中的应用。总体而言，4,6-α-GTase能够通过减少回生、改变面团或糊的流变学和储存稳定性来影响淀粉食品特性。淀粉回生是淀粉基食品品质劣变的主要原因之一，特别是面包的陈化。通过降低直链淀粉含量、缩短支链淀粉分支链长度以及引入干扰线性链排列的α-(1,6)键，4,6-α-GTase可减少淀粉链形成稳定双螺旋的能力。St GtfB处理的小麦淀粉与对照相比，使用较高量酶（4 U/g）处理的淀粉在第一周和第二周的回生程度低于使用较低量酶（1 U/g）处理的淀粉和未处理对照样品。酶处理还可改善面团和面包的流变学和体积特性。在小麦面团中，St GtfB处理降低了直链淀粉含量、支链淀粉分支长度和分子量，导致储能模量（G
'）和损耗模量（G
"）降低，表明酶处理削弱了生物大分子网络，改善了面团行为并提高了比容。4,6-α-GTase还在小麦面包和无麸质面包系统中表现出抗陈化效果，处理后的面包具有更好的外观、更细腻的结构和随时间更柔软的质地。通过联合4,6-α-GTase和分支蔗糖酶处理产生的异麦芽糊精显示出比麦芽糊精更好的冻融稳定性，其浊度在反复冻融循环后保持相对恒定，且对Maillard反应条件、酸加热处理和消化具有抗性。淀粉的物理状态是另一个决定酶对其技术功能性质影响的重要因素，与颗粒淀粉相比，糊化淀粉通常对4,6-α-GTase更敏感。
**5. 4,6-α-GTase与其他淀粉活性酶的比较功能分析**
多种淀粉活性酶，特别是来自GH13、GH77和GH57的酶，已在食品工业中用于烘焙、酿造、淀粉液化、麦芽糊精和葡萄糖浆生产等应用。这些酶通过水解、转糖基化或环化反应修饰淀粉，从而改变分子量、大小和链长分布、分支密度、结晶度等。水解型淀粉作用酶是食品工业中最常用的酶。α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）是食品工业应用中最为成熟和广泛使用的淀粉作用酶，它们随机水解直链淀粉和支链淀粉内部的α-(1,4)键，产生糊精和麦芽寡糖，从而降低粘度。支链淀粉酶（EC 3.2.1.41）和异淀粉酶（EC 3.2.1.68）则通过水解支链淀粉及相关α-葡聚糖中的α-(1,6)分支点发挥作用。转糖基化型酶则重新排列或改变淀粉分子的结构，分支酶（EC 2.4.1.18）切割α-(1,4)键并将葡聚糖片段转移以形成新的α-(1,6)分支点。环糊精糖基转移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）将淀粉链转化为环寡-多糖，4-α-葡聚糖转移酶（EC 2.4.1.25）则重新排列葡聚糖链的α-(1,4)键。与这些酶相比，4,6-α-GTase在需要结构重组而不希望过度水解时具有潜在应用优势，如在面包或淀粉凝胶等食品体系中，它可修饰淀粉结构而不造成过度的链断裂。与分支酶相比，4,6-α-GTase能够产生线性α-(1,6)富集葡聚糖如IMMP，或甚至分支α-葡聚糖如类Reuteran碳水化合物，提高了其在膳食纤维、益生元补充剂或烘焙工业等各种应用中的多功能性。
**6. 未来展望**
目前大多数已表征的4,6-α-GTase来源于有限的微生物来源，主要为乳杆菌属，因此发现新的潜在细菌物种和菌株以满足未来应用非常重要。4,6-α-GTase的多结构域结构和高分子量限制了其有效的异源表达和可溶性蛋白回收，这限制了其在工业和生物技术中的应用。N/C末端区域的截断已被用于提高4,6-α-GTase在大肠杆菌中的可溶性表达，但该技术可能影响底物结合、稳定性或产物特异性。需要进一步研究以改进表达策略，如密码子优化、分子伴侣共表达、食品级微生物宿主和发酵优化。此外，固定化是改善4,6-α-GTase工业可行性的尚未充分探索的策略，可通过吸附、共价结合、包埋、封装或交联提高酶的回收和稳定性。目前4,6-α-GTase的应用已在相对狭窄的食品基质范围内进行了检验，其对复杂食品基质的影响仍不清楚，需要进一步研究面条、意大利面、烘焙产品、饮料、汤、酱、布丁和乳制品等体系。4,6-α-GTase与其他淀粉活性酶的组合是另一个尚未充分开发的方向，涉及分支蔗糖酶、环糊精糖基转移酶和4-α-GTase、支链淀粉酶或其他GH70酶的酶混合物或顺序酶处理策略可能提供尚未探索的功能性α-葡聚糖新品种。酶的安全性和监管状态是另一个尚未探索的方向。
**7. 结论**
总之，较高含量的SDS和RS通过促进淀粉到达结肠并增强SCFAs的形成，有助于使淀粉更健康，这与预防多种疾病相关。4,6-α-GTase反应混合物的碳水化合物终产物表现出对消化酶的相当抗性，能够到达结肠，这通过各种体外和体内研究得到证实。此外，如众多研究所观察，该酶能有效降低各种淀粉类型和淀粉类食品（如面包和馒头）的回生性，这归因于直链淀粉含量的降低。尽管该酶已引起广泛关注并被广泛研究，但仍需更多研究以充分理解其功能并实现其在食品工业中的高效应用，包括益生元补充剂和低热量食品的生产。
