《Food Microbiology》：Mechanistic insights into acid-induced viable but non-culturable state formation regulated by asr in Escherichia coli O157:H7: roles of intracellular protein aggregation
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Xinyu Ma|Yanan Wu|Jiajing Zhang|Jun Li|Qing Ren|Hanxu Pan|Zhanbin Sun北京工商大学轻工科学与工程学院，中国北京100048摘要食品加工过程中，细菌会面临多种压力，这些压力会导致其进入存活但无法培养的状态，从而带来
Xinyu Ma|Yanan Wu|Jiajing Zhang|Jun Li|Qing Ren|Hanxu Pan|Zhanbin Sun
北京工商大学轻工科学与工程学院，中国北京100048
摘要
食品加工过程中，细菌会面临多种压力，这些压力会导致其进入存活但无法培养的状态，从而带来食品安全风险。高压二氧化碳这种非热处理技术主要通过低pH值压力促使大肠杆菌O157:H7进入此类状态。有研究推测，酸应力基因asr会介导细胞内蛋白质聚集，进而促进VBNC状态的形成，但其具体机制尚不明确。本研究通过施加pH为3的酸应力，探讨asr在VBNC状态形成中的调控作用。经过30小时的酸应力处理后，大肠杆菌O157:H7进入了VBNC状态，同时asr基因的表达显著上升，而与酸抗性相关的基因表达则受到抑制。这种抑制现象阻碍了细胞内质子的消耗，降低了细胞质pH值，最终引发了细胞内蛋白质聚集。经分析，这些聚集的蛋白质主要与能量产生与转换、氨基酸/碳水化合物的运输与代谢、细胞膜结构形成、转录与翻译以及复制、重组和修复等相关功能有关。蛋白质聚集会降低细胞内ATP水平，而在细胞复苏过程中，蛋白质聚集体的解体又能恢复ATP水平。此外，Δasr菌株在酸应力作用下既不能形成VBNC细胞，也不会出现蛋白质聚集现象，而在补充了asr基因的菌株中，这些表型又重新出现。转录组分析显示，Δasr菌株的应激感知能力有所下降，同时与蛋白质重折叠和毒力相关的基因表达上升，高效碳源的利用能力增强，对酸的响应更加强烈，而且毒素-抗毒素系统的表达也受到抑制。这些变化使得细菌更倾向于死亡而非进入VBNC状态。总体而言，本研究表明，HPCD处理诱导的asr基因表达会促进细胞内蛋白质聚集，从而形成低能量状态，进而帮助大肠杆菌O157:H7进入VBNC状态。
引言
在各种食品加工过程中，恶劣的生存环境会给微生物带来挑战，尤其是对病原性和腐败性微生物而言。为了应对这些严苛的环境压力并确保长期生存，微生物进化出了一种独特的生存策略，即进入存活但无法培养的VBNC状态（Dong等人，2020）。处于VBNC状态的细胞无法在常规培养基上生长和形成菌落，但仍然具有存活能力，且在适宜条件下可以复苏并恢复培养能力（Oliver，2005）。更为关键的是，这类VBNC细胞在休眠状态下仍可能具备致病性，食源性病原体在食品加工、储存或被人体摄入后可能会复苏，重新获得完整的代谢功能和致病性（Colwell等人，1996；Fakruddin等人，2013）。在牛奶、三文鱼、家禽和橙汁等多种常见食品中都发现了处于VBNC状态的食源性病原体，这大大增加了食源性疾病爆发的风险，对食品安全和公众健康构成了严重威胁（Anvarian等人，2018；Gerrard等人，2018；Lindb?ck等人，2010；Purevdorj-Gage等人，2018）。因此，关于VBNC状态的研究已成为食品微生物学和食品安全领域的核心研究课题。
近年来，包括高压处理、脉冲电场处理、超声处理、高压二氧化碳处理以及冷大气等离子体处理在内的非热食品加工技术，都被发现有可能使微生物进入VBNC状态（Wu等人，2025）。其中，高压二氧化碳处理通过多种机制发挥协同杀菌作用，这些机制包括高压作用（5-50 MPa）、酸化作用、厌氧环境以及快速减压作用（Zhou等人，2015）。在HPCD处理诱导的VBNC状态的大肠杆菌O157:H7细胞中，与膜转运、核心碳代谢、DNA复制和细胞分裂相关的基因和蛋白质表达显著下降，同时与致病性相关的基因表达也有所降低（Zhao等人，2016）。与细胞分裂相关的dicC和dicA基因也与细胞进入HPCD诱导的VBNC状态有关。dicC和dicA对细胞生长速率的调节作用，以及细胞体积的缩小，都与VBNC状态的形成呈正相关（Pan等人，2019）。此外，外膜蛋白OmpF也会影响VBNC状态的形成，因为ompF基因的过表达会促进大肠杆菌O157:H7进入VBNC状态（Zhao等人，2016）。
关于HPCD的多种协同应力作用，已有研究证明高压作用会加速细菌进入VBNC状态，而由溶解的加压二氧化碳产生的酸化作用（pH 3）则是最主要的诱导因素（Yang等人，2022）。这一结论在HPCD处理后大肠杆菌O157:H7的asr基因表达出现显著上升（高达118.60倍）的情况下得到了进一步证实（Pan等人，2023）。asr基因编码的一种酸休克蛋白，主要在轻度酸性环境（pH 3.0–4.5）下发挥作用，比如在HPCD处理的情况下（Furukawa等人，2015；Seputiene等人，2003）。据认为，asr基因可以调控下游靶基因的表达，帮助细菌适应轻度酸应力，提升其对强酸性环境的耐受能力（Ramos-Morales，2012）。在大肠杆菌中，另一种酸应答系统是依赖氨基酸脱羧酶的酸抗性系统，该系统主要在强酸性环境（pH < 2.5）下被激活（Ramos-Morales，2012）。酸抗性系统主要是通过相应的脱羧酶使谷氨酸、精氨酸和赖氨酸发生脱羧反应，从而消耗细胞内的质子，维持细胞内pH值的稳定（Ramos-Morales，2012；Richard & Foster，2004）。在之前的研究中，我们提出假设：HPCD的酸化作用会促使asr基因的高表达，进而抑制酸抗性系统，引发细胞内蛋白质聚集，最终推动大肠杆菌O157:H7进入VBNC状态（Pan等人，2023）。不过，这一过程背后的具体分子机制目前仍不太清楚。
因此，为了验证上述假设，本研究采用酸应力（即HPCD处理的主要因素，pH为3）来诱导VBNC状态，旨在系统地阐明asr基因在通过调控细胞内蛋白质聚集来促进大肠杆菌O157:H7在酸处理下形成VBNC状态过程中的作用机制。本研究的结果将为防止非热加工过程中食源性病原体进入VBNC状态提供有力的理论依据，进而保障食品质量和公众健康安全。
章节要点
细菌菌株及培养条件
本研究所使用的细菌菌株和质粒信息详见表S1。野生型大肠杆菌O157:H7和Δasr菌株均在37℃下于Luria-Bertani培养基中培养，培养时以200转/分钟的速度振荡。将过夜培养的菌液按1:100的比例稀释后转移到新鲜的LB培养基中，继续在37℃下振荡培养，直到菌液达到指数生长阶段，此时OD600值为0.8。在补充了asr基因的菌株中，需添加50 μg/L的卡那霉素以维持质粒的稳定存在。
VBNC状态的诱导与检测
大肠杆菌O157:H7的VBNC状态是通过酸应力来诱导的，
酸处理诱导的VBNC状态下细胞内H+积累现象
先前的研究已经表明，酸化作用在HPCD诱导的大肠杆菌O157:H7形成VBNC状态的过程中起着至关重要的作用（Pan等人，2023；Yang等人，2022）。而其他因素，如5 MPa的高压处理，则没有明显影响（Yang等人，2022）。经过酸处理的细胞在形态上与经过HPCD处理的细胞相似，表现为细胞表面粗糙、收缩且凹陷，细胞质呈现聚集状态，而且原生质体内还会形成空腔（Yang等
结论
本研究采用了pH为3的酸应力作为核心处理因素，该因素也是HPCD处理的作用基础，通过该处理可诱导大肠杆菌O157:H7进入VBNC状态，同时asr基因的转录水平也会显著上升。从机制上看，asr基因表达水平的升高会抑制细菌的酸抗性系统功能，这一现象与细菌在酸处理后相关酸抗性基因（adiA/C和gadA）表达显著下降的情况一致。这种抑制作用会打破细胞内的质子平衡，进而导致
CRediT作者贡献说明
Jiajing Zhang：方法设计、实验研究、定量分析。Jun Li：数据可视化、软件应用、研究资源获取、定量分析。Qing Ren：软件应用、研究资源获取、方法设计。Hanxu Pan：论文撰写与修改、初稿撰写、数据可视化、结果验证、研究监督、资金筹集、定量分析、概念构建。Zhanbin Sun：论文撰写与修改、数据可视化、结果验证、研究监督、软件应用、实验研究。Xinyu Ma：方法设计、实验研究、定量分析、数据收集
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
作者特此感谢中国国家自然科学基金委员会（NSFC）的资助，资助编号为32302245。
