内皮细胞AGO1缺失减轻小鼠乳腺癌负荷

《Angiogenesis》：Endothelial AGO1 deficiency reduces breast cancer burden in mice

　　

内皮细胞（Endothelial cells, ECs）在癌症发展和进展中至关重要，部分通过调控肿瘤血管生成（angiogenesis）和免疫调节发挥作用。作为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）的关键组分，Argonaute 1（AGO1）调控肿瘤生物学，然而AGO1在内皮细胞中于肿瘤微环境内的特定功能尚不明确。本研究调查了内皮特异性AGO1敲除（endothelial-specific AGO1 knockout, EC-AGO1-KO）对E0771细胞诱导的鼠同系基因乳腺癌模型中肿瘤血管化和免疫调节的影响。与野生型（wild-type, WT）同窝对照相比，EC-AGO1-KO小鼠表现出显著降低的肿瘤负荷，伴随血管化减少和免疫细胞浸润增强。组织学和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析显示EC-AGO1-KO肿瘤中CD8⁺ T细胞和巨噬细胞浸润增加，提示免疫刺激性微环境。体外实验中，与E0771肿瘤细胞共培养的小鼠内皮细胞中AGO1敲低导致Cxcl10和Vcam1表达水平升高，提示促炎性和白细胞招募效应。这些发现共同确定内皮AGO1为乳腺癌中肿瘤血管系统和免疫稳态的关键调控因子，提示靶向内皮AGO1可能代表一种调控肿瘤血管化同时增强抗肿瘤免疫的新型治疗策略。

## 研究背景与问题提出

肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的复杂性是制约癌症治疗效果的关键因素之一。内皮细胞（endothelial cells, ECs）作为肿瘤血管系统的核心构成，不仅通过血管生成（angiogenesis）为肿瘤提供营养和氧气，还深度参与免疫调节过程，影响抗肿瘤免疫应答的成效。Argonaute 1（AGO1）是RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）的关键组分，通过小RNA介导的基因沉默机制调控基因表达，在肿瘤生物学中发挥重要作用。已有研究揭示AGO1在肿瘤细胞中的功能具有情境依赖性，但其在肿瘤内皮细胞中的特定角色尚未阐明。研究人员此前发现，非肿瘤内皮细胞中AGO1的抑制可在缺氧条件下增强VEGF-A表达和血管生成，且内皮条件性AGO1敲除（EC-AGO1-KO）小鼠可免于饮食诱导的肥胖、高脂血症和动脉粥样硬化。然而，内皮AGO1在肿瘤血管系统和免疫调节中的功能仍是空白领域，这促使研究人员开展本项研究以探索其潜在机制及临床意义。

## 主要技术方法

本研究采用E0771乳腺癌同系移植模型，将肿瘤细胞植入WT和EC-AGO1-KO雌性小鼠乳腺脂肪垫构建内皮特异性AGO1缺失的肿瘤模型；利用免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）技术对肿瘤组织切片进行CD31、Ki67、TUNEL、CD8及F4/80染色；采用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术对肿瘤样本进行细胞群体解析；建立小鼠内皮细胞系MS1与E0771肿瘤细胞的Transwell共培养体系进行体外机制研究；运用定量PCR（quantitative PCR, qPCR）检测基因表达水平。

## 研究结果

### 内皮AGO1缺失抑制肿瘤生长

研究人员将E0771乳腺癌细胞植入16周龄雌性EC-AGO1-KO小鼠及其WT同窝对照的乳腺脂肪垫。第7天时所有小鼠均形成可触及肿瘤（>10 mm³），但至第21天，EC-AGO1-KO小鼠肿瘤体积显著小于WT对照，约50%的小鼠肿瘤无法检出，且肿瘤外观呈现更苍白的颜色。两组小鼠循环雌二醇水平相当，排除了激素变异对表型的影响。该结果明确证明内皮AGO1缺失可显著减轻乳腺癌负荷。

### 内皮AGO1缺失减少肿瘤血管化

通过CD31免疫组织化学染色及血管面积与连接点密度的定量分析，研究人员发现EC-AGO1-KO肿瘤血管化程度显著降低。Ki67染色减少和TUNEL染色增加分别提示肿瘤细胞增殖受到抑制和凋亡增强，且这些差异在第14天即已显现。该结果表明内皮AGO1通过促进肿瘤血管生成支持肿瘤生长。

### 内皮AGO1缺失增强免疫细胞浸润

免疫组织化学分析显示，EC-AGO1-KO肿瘤中CD8⁺ T细胞和F4/80⁺巨噬细胞浸润显著增加。单细胞RNA测序进一步解析了肿瘤中的细胞组成，鉴定出9个非肿瘤细胞聚类。与WT肿瘤相比，EC-AGO1-KO肿瘤中T细胞和巨噬细胞比例显著上升，活化T细胞标志基因（Cd8a、Stat3、Cblb、Gzmb）表达上调。在巨噬细胞群体中，组织驻留巨噬细胞（以Cadm1、Mertk、Zeb2、Cd53为标志）增加，而免疫抑制性M2样巨噬细胞（以Mrc1和Arg1为标志）减少；同时巨噬细胞表达更高水平的免疫刺激性Cxcl9/10和更低水平的免疫抑制性Arg1和Il10。这些数据共同提示EC-AGO1-KO肿瘤形成了更为免疫刺激性的微环境。

### AGO1敲低内皮细胞的促炎性和白细胞招募效应

鉴于单细胞RNA测序捕获的内皮细胞数量有限，研究人员采用内皮-肿瘤细胞共培养模型探究内皮细胞内在基因程序。与E0771细胞共培养的小鼠AGO1敲低内皮细胞表现出Cxcl10和Vcam1表达升高，而Kdr和Nos3表达无变化。与之一致，EC-AGO1-KO肿瘤中Cxcl9、Cxcl10和Selp（编码P-selectin）表达上调，表明AGO1抑制促进内皮细胞的白细胞招募功能，而非导致血管功能障碍。此外，AGO1敲低内皮细胞的条件培养基可减少E0771细胞迁移，同时降低转移相关趋化因子受体CXCR4表达并增加肿瘤抑制性转录阻遏子RUNX1T1表达，提示内皮AGO1可能通过直接作用于肿瘤细胞调控癌症发展。

## 讨论与结论总结

本研究首次揭示了内皮AGO1在肿瘤进展中的先前未被认识的作用。研究发现EC-AGO1抑制可减少肿瘤血管化、增加免疫细胞浸润并降低小鼠乳腺癌模型中的肿瘤负荷，凸显了内皮细胞在塑造肿瘤行为和微环境中的核心地位，并将AGO1确立为内皮-肿瘤轴中的关键调控节点。研究结果表明，内皮AGO1通过双重机制发挥作用：一方面促进肿瘤血管生成，另一方面抑制免疫刺激性微环境的形成。靶向内皮AGO1可能提供一种创新治疗途径，通过破坏异常肿瘤血管生成、促进免疫细胞浸润来增强现有癌症疗法的疗效。研究人员同时指出，尚需进一步研究以确立该发现在不同肿瘤类型中的普适性，并深入探索内皮AGO1调控肿瘤细胞的旁分泌机制。

研究结论部分指出：内皮AGO1缺失减轻小鼠乳腺癌负荷，EC-AGO1敲除通过减少血管化和增强免疫浸润抑制肿瘤生长；体外AGO1敲低诱导内皮细胞促炎性和白细胞招募基因表达；靶向内皮AGO1是调控肿瘤血管和增强抗肿瘤免疫的潜在治疗策略。