台湾角膜炎患者分离棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)中Holosporales目内共生菌的首度鉴定

《Journal of Microbiology, Immunology and Infection》：First Identification of Holosporales Endosymbionts in Acanthamoeba spp. Isolated from Keratitis Patients in Taiwan

　　

背景：棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)为广泛存在于环境中的自由生活阿米巴原虫，是公认的机会性人类病原体。阿米巴内的内共生关系——尤指与细菌的内共生——可增强宿主及共生菌的致病潜能，进而影响公共卫生风险。本研究旨在对临床分离的棘阿米巴进行鉴定表征，并明确其体内细菌内共生菌的种类及定位。 方法：收集环境及临床棘阿米巴分离株，经形态学分析及18S rRNA基因测序鉴定；采用针对细菌16S rRNA基因及gltA（柠檬酸合酶编码基因）基因的PCR扩增检测细菌内共生菌存在与否，并通过系统发育分析对棘阿米巴及其细菌内共生菌进行分类。 结果：PCR及培养法在临床样本中检出棘阿米巴阳性率为40%；系统发育分析显示所有临床分离株均属T4基因型，环境株分属T3、T4及T5基因型；以棘阿米巴18S rDNA之DF3区进行系统发育分析，将临床及环境分离株划分为6个T4亚基因型。两株临床分离株经16S rRNA及gltA基因分析证实携带Holosporales目细菌内共生菌；荧光显微镜观察到符合内共生菌定位特征的胞内含DNA结构。 结论：本研究揭示了台湾临床与环境来源棘阿米巴分离株的遗传多样性，并强调细菌内共生菌的普遍存在。上述发现提示需持续监测并开展进阶基因组研究，以阐明内共生菌—棘阿米巴相互作用及其对公共卫生的潜在影响。

论文解读：台湾角膜炎患者分离棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)中Holosporales目内共生菌的首度鉴定

本研究发表于《Journal of Microbiology, Immunology and Infection》。

研究背景与立项依据

棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)是广泛分布于土壤、水体等环境的自由生活阿米巴原虫，可耐受极端条件，是棘阿米巴性角膜炎(Acanthamoeba keratitis, AK)——一种严重威胁视力的接触镜相关感染性疾病——的主要病原，也可引起肉芽肿性阿米巴性脑炎(granulomatous amoebic encephalitis, GAE)等播散性疾病。全球AK发病率上升，台湾由于隐形眼镜佩戴率高，AK漏诊误诊率亦较高。目前棘阿米巴按18S rRNA分为23个基因型(genotype)，其中T4基因型与AK关系最为密切，其18S rRNA高度可变DF3区可进一步细分亚基因型(sub-genotype)。棘阿米巴可作为"特洛伊木马"容纳支原体、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、军团菌(Legionella)及Holosporales目等多种微生物形成棘阿米巴耐药菌(Acanthamoeba-resistant bacteria, ARBs)，增强其抗氯性、毒力及胞内存活能力，但目前尚无直接证据证明Holosporales目内共生菌可增强棘阿米巴致病性或改变其代谢生理，且台湾尚未见棘阿米巴体内Holosporales目内共生菌的报道。因此，研究人员开展本研究以表征临床棘阿米巴分离株并鉴定及定位其细菌内共生菌。

主要关键技术方法

研究人员收集2016年1月至2020年12月某三级医院眼科疑似AK患者的20份临床样本（角膜溃疡拭子、隐形眼镜及镜盒液体）及4份已发表的环境水库样本；采用非营养琼脂(non-nutrient agar, NNA)平板以热灭活大肠埃希菌(Escherichia coli) DH5α覆盖进行阿米巴分离，传代后经含庆大霉素的蛋白胨酵母葡萄糖(PYG)培养基进行无菌(axenic)培养；提取阿米巴DNA后，以JDP引物扩增18S rRNA基因进行棘阿米巴基因分型，以通用细菌引物扩增16S rRNA基因及研究人员自行设计简并引物扩增gltA基因检测内共生菌，并以巢式PCR检测微孢子虫(Microsporidia)及真菌；测序后采用MEGA软件ClustalW比对、邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树（1000次自举检验）；取无菌培养的阿米巴滋养体经多聚甲醛固定、透化后，以鬼笔环肽(Phalloidin-iFluor 532)染肌动蛋白、DAPI(4′,6-二氨基-2-苯基吲哚)染DNA，激光共聚焦显微镜观察内共生菌定位。

研究结果

Detection of Acanthamoeba sp. and its phylogenetic analysis（棘阿米巴检测及其系统发育分析）

研究人员以JDP引物对20份临床样本行18S rRNA基因PCR，8份(40%)阳性，7份(35%)培养出棘阿米巴。BLAST及系统发育分析显示7株临床分离株及1株环境株(S-LYT)均属T4基因型，环境株W-DG属T3基因型近格里芬棘阿米巴(A. griffini)，S-AGD与W-MD属T5基因型近透镜状棘阿米巴(A. lenticulata)。以DF3区对T4株行亚基因型分析，临床株分布于T4A、T4B、T4D、T4E及一新T4A/B/C分支，其中携带内共生菌的两株(TVGH9、TVGH12)均归入T4B亚基因型。结论：台湾临床AK分离株均为T4基因型，具T4亚基因型多样性，部分属T4B。

Detection of Acanthamoeba endosymbiont and its phylogenetic analysis（棘阿米巴内共生菌检测及其系统发育分析）

两株临床株TVGH9与TVGH12经16S rRNA基因PCR阳性，分别命名为ARB9（登录号PQ877378）与ARB12（登录号PQ877379）。16S rRNA BLAST显示ARB9与棘阿米巴内共生菌UWC8相似度99.54%，ARB12与"Candidatus Paracaedibacter acanthamoebae" PRA3相似度99.35%，均属Holosporales目——ARB9归Holosporaceae科，ARB12归Candidatus Paracaedibacteraceae科。研究人员设计的gltA简并引物扩得约1000 bp产物，无内共生菌株及对照菌无扩增；gltA系统树较16S rRNA更好区分Holosporales与Rickettsiales，ARB9与UWC8聚于Holosporaceae（bootstrap 99%），ARB12与PRA3聚于Candidatus Paracaedibacteraceae。内共生菌16S rRNA序列高度保守（ARB9与UWC8/IMU7仅0.12%差异，ARB12与KA/MG/BACD/PRA3仅0.51%差异），而其棘阿米巴宿主18S rRNA JDP或V4区差异显著（6.49%及37.6%）。结论：首次在台湾棘阿米巴临床分离株中发现Holosporales目内共生菌，分属Holosporaceae及Candidatus Paracaedibacteraceae，gltA基因为更优的系统发育分辨标记。

Localization bacterial endosymbionts of Acanthamoeba sp.（棘阿米巴细菌内共生菌定位）

DAPI及鬼笔环肽荧光染色显示，无内共生菌标准株ATCC 30010仅见少量胞质DAPI信号，而TVGH9（ARB9）与TVGH12（ARB12）滋养体胞质内可见沿分布、呈杆状或点状的DAPI阳性含DNA结构，符合细菌内共生菌特征，ARB9信号较ARB12更丰富；鬼笔环肽染色显示棘阿米巴表面棘状伪足(acanthopodia)及皮质肌动蛋白网络完整。结论：Holosporales目内共生菌定位于棘阿米巴胞质内，不破坏宿主细胞骨架完整性，负荷差异可能反映复制速率或宿主调控不同。

讨论与结论总结

讨论部分指出PCR检测棘阿米巴敏感性高于传统培养；所有临床株为T4基因型与全球报道一致，环境中T3/T5的存在提示水源性感染可能；本研究首次报道台湾棘阿米巴Holosporales目内共生菌，分别与美国西雅图临床株UWC8及马来西亚空调尘样IMU7、韩国与巴西已报道株密切相关，暗示该类内共生菌全球广布；T4B亚基因型与内共生菌的关联需更多数据验证；gltA基因作为第二分子标记提高了Holosporales内共生菌鉴别分辨率；荧光显微镜证实内共生菌胞质定位且宿主骨架完好。研究局限性包括样本量有限、缺详细临床资料关联、16S rRNA可能漏检低丰度菌、未行功能实验及FISH验证、未测内共生菌耐药谱。

结论(Conclusion)：本研究揭示了临床及环境来源棘阿米巴分离株的遗传多样性及细菌内共生菌的普遍存在，首次于台湾报道棘阿米巴携带Holosporales目内共生菌。这些发现强调需持续监测并开展先进基因组研究以了解内共生菌—棘阿米巴相互作用及其对公共卫生的潜在影响。