《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：RNA helicase DDX5 alleviates UVB-induced skin DNA damage through RBM15/METTL14-mediated m6A modification
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高伟|黄方舟|李思琪|高飞|艾晨|韩雪婷|吕敏婷|陈薇静|李珍珠|张慧燕|李青青|王宇帅中国安徽省蚌埠市东海大道2600号，蚌埠医学院安徽生化制药工程技术研究中心药学系，邮编233030摘要紫外线辐射引起的DNA损伤是皮肤癌变和早衰的重要诱因。了解DNA损伤修复的机制对于预防这些
高伟|黄方舟|李思琪|高飞|艾晨|韩雪婷|吕敏婷|陈薇静|李珍珠|张慧燕|李青青|王宇帅
中国安徽省蚌埠市东海大道2600号，蚌埠医学院安徽生化制药工程技术研究中心药学系，邮编233030
摘要
紫外线辐射引起的DNA损伤是皮肤癌变和早衰的重要诱因。了解DNA损伤修复的机制对于预防这些皮肤疾病至关重要。蛋白质组分析显示，UVB照射的细胞中RNA解旋酶DDX5的表达显著下降，这一现象与核苷酸切除修复及mRNA代谢过程密切相关。尽管DDX5已被证实与细胞周期调控及依赖解旋酶的DNA修复有关，但其在减轻紫外线引发的DNA损伤中的具体功能及作用机制仍不明确。与蛋白质组数据一致，西方印迹分析也证实UVB辐射能在体外和体内上调DDX5的表达。为进一步确认DDX5的作用，通过siRNA转染和脂质转染在UVB照射的HaCaT细胞中调节DDX5表达，同时通过AAV转导在小鼠中实现该调控。功能实验表明，过表达DDX5可有效逆转UVB引发的细胞凋亡、DNA损伤、γH2AX焦点形成以及环丁烷嘧啶二聚体的生成，而敲低DDX5则会加剧这些效应。共免疫沉淀实验发现DDX5与甲基转移酶复合物的亚基如RBM15和METTL14存在直接相互作用。MeRIP-seq和MeRIP-qPCR分析进一步表明，DDX5过表达会提高编码关键DNA修复因子（LIG1、RFC2和RAD51）的mRNA的m6A修饰水平，同时这些修复因子的mRNA和蛋白水平也会显著上升。同样，使用环亮氨酸抑制m6A甲基化或敲低RBM15/METTL14会消除DDX5的保护作用，并逆转其介导的修复因子表达上调。综上所述，这些研究结果表明DDX5通过与RBM15/METTL14相互作用，促进DNA修复因子mRNA的m6A修饰，从而提升其表达水平，助力修复紫外线引起的DNA损伤。
引言
作为人体最大的器官，皮肤直接暴露在阳光及其有害的紫外线辐射下。长期暴露于紫外线会破坏包括DNA、蛋白质和脂质在内的生物大分子，还会激活一系列信号通路，引发细胞凋亡、细胞外基质降解、色素沉着、免疫抑制、炎症，最终导致癌症发生[1]。在各种紫外线引起的损伤中，DNA损伤尤为常见。这类损伤主要包括嘧啶二聚体，如环丁烷嘧啶二聚体和(6–4)光产物，以及氧化加合物，比如8-羟基-2′-脱氧鸟苷[2]。与大多数生物体中存在的、可通过光复活直接修复紫外线诱导的DNA损伤的光解酶不同，胎盘哺乳动物缺乏这种修复途径，只能依靠核苷酸切除修复机制来清除诸如CPDs和6–4PP之类的损伤[3]。NER途径通过逐步过程发挥作用：损伤识别、双切口形成、DNA合成以及连接[4]。在DNA合成过程中，异五聚体RFC复合物会将PCNA加载到DNA上，其中RFC2是不可或缺的亚基[5]。值得注意的是，RFC2还负责将PCNA从DNA上卸下，同时参与细胞周期检查点信号传导，因此在协调整个DNA修复过程中起着关键作用[6]。随后，ATP依赖性的DNA连接酶LIG1会对接上的DNA缺口进行连接，它在多种DNA修复和复制途径中与LIG3α具有功能冗余性[7]。未被修复的DNA损伤可能导致复制叉崩溃并形成双链断裂。另一方面，同源重组机制可以精准修复双链断裂，该过程首先通过末端切除形成RAD51丝状结构以实现链侵入，随后进行DNA合成、链延伸，最后以姐妹染色单体为模板解决霍利迪连接问题[8]。因此，进一步阐明DNA损伤修复的分子机制对于减轻紫外线引起的皮肤光损伤具有重要意义。
DDX5是一种关键的RNA解旋酶，在DNA损伤反应中发挥着多方面的调控作用[9]。Yu等人研究表明，去除DDX5会导致DNA损伤位点处出现R环，即DNA/RNA混合的三链结构，进而阻碍RPA、EXO1和RAD51的招募，降低同源重组修复的效率[10]。进一步的机制研究显示，DDX5分解R环并促进DNA修复因子招募的能力与其与BRCA2的相互作用密切相关[11]。此外，DDX5还能促使p53和RNA Pol II聚集到p21启动子处，从而驱动p21转录，引发G1/S细胞周期停滞，为DNA修复争取时间[12]。同时，DDX5还能独立于TDRD3，通过与TOP3B相互作用，分解由喜树碱和普拉地诺醇B诱导的R环，维持基因组稳定性[13]。综上所述，DDX5的这些多重功能使其成为维持基因组稳定的重要调节因子，这也暗示它可能参与紫外线诱导的DNA损伤修复。
作为DNA损伤的动态传感器，m6A会在DNA损伤部位局部积累，尤其是在靠近DNA双链断裂的R环区域。这种时空分布模式有助于吸引包括跨损伤聚合酶POLK、RAD51和BRCA1在内的修复因子聚集到损伤部位，从而促进双链断裂的修复[14]。Svobodova Kovarikova等人发现，经过紫外线处理的染色质中，m6A修饰的mRNA会迅速积累，这一过程很可能是通过扩散而非新转录实现的，而且这种积累会伴随NER修复过程的启动[15]。这表明表转录组在紫外线诱导的DNA损伤反应中起着关键作用。值得关注的是，越来越多的证据表明DDX5与m6A甲基转移酶存在相互作用。Zhu等人报道，DDX5与METTL3相互作用，促进PAK6 mRNA的m6A修饰，该mRNA会被IGF2BP1稳定下来，随后PAK6可通过MAPK14 Ser56磷酸化推动宫颈癌的发展[16]。Xu等人也证实，DDX5通过与METTL3相互作用，调节抗病毒相关mRNA的m6A修饰水平，从而抑制抗病毒先天免疫反应，促进病毒复制[17]。不过，DDX5在紫外线诱导的DNA损伤背景下对m6A修饰的调控作用及其背后的分子机制仍有待进一步研究。
在本研究中，我们发现过表达DDX5能够在体外和体内显著促进皮肤中UVB诱导的DNA损伤修复。从机制上看，DDX5与甲基转移酶RBM15和METTL14相互作用，增强编码DNA修复因子的mRNA的m6A修饰水平，包括RFC2、LIG1和RAD51等，进而提升这些因子的表达水平及其DNA修复能力。值得注意的是，使用环亮氨酸处理或敲低RBM15/METTL14都会消除DDX5的DNA修复促进作用。综上，这些研究结果证实DDX5是紫外线诱导的DNA损伤修复的关键调节因子，同时为其作为预防和治疗皮肤癌的新靶点提供了依据。
章节摘录
细胞培养与UVB照射
本研究使用的HaCaT细胞（编号CL0114，来自中国湖南凤凰生物科技有限公司）在含5%二氧化碳的37℃环境下，于添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。当细胞在培养皿中的密度达到80%时，用PBS冲洗细胞，然后按照先前描述的方法[18]，使用Bio-Link交联剂（BLX-312，来自法国Collégien的Vilber Lourmat GmbH）对其施加UVB照射。UVB照射后，细胞再接受环亮氨酸处理（编号C830431；
UVB照射在体外和体内调控DDX5表达
为探究细胞对紫外线照射的反应，将HaCaT细胞暴露于UVB辐射下，随后进行蛋白质组分析。火山图分析显示，UVB处理引发了大量的蛋白质组变化（见图1A）。通过对差异表达蛋白的KEGG通路分析，发现细胞周期、细胞凋亡以及核苷酸切除修复通路显著活跃（见图1B）。GO-BP分析则进一步显示，mRNA调控相关通路也有明显富集现象
讨论
紫外线辐射引起的DNA损伤是黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌等皮肤恶性肿瘤的重要诱因[28]、[29]。哺乳动物细胞已经进化出专门的DNA修复途径来应对这类损伤[30]、[31]。虽然这些核心修复机制已经被深入研究，但其上游的分子调控因子，尤其是像N6-甲基腺苷这种转录后调控网络，目前仍了解不多
CRediT作者贡献说明
高伟：指导、资源提供、论文撰写——审阅与编辑。 黄方舟：论文撰写——初稿撰写、可视化处理、软件应用、实验开展、定量分析、数据整理。 李思琪：结果验证、实验开展、定量分析、方法设计、可视化处理。 高飞：可视化处理、方法设计、数据整理。 艾晨：方法设计、实验开展、数据整理、可视化处理。 韩雪婷：结果验证、方法设计、实验开展、数据整理、可视化处理。 吕敏婷：结果验证、方法设计，
致谢
本研究得到了以下项目的资助：国家自然科学基金（编号82103755）、安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目（编号YQZD2023061、YQYB2024040）、安徽省教育委员会自然科学科研项目（编号2024AH030042、2024AH051242）、蚌埠医学院龙湖人才项目（编号LH250102001）、国家大学生创新创业训练计划（编号202410367018、202410367080
