Igalan通过共价靶向NLRP3(NLR家族pyrin结构域 containing 3)炎症小体通路减轻脓毒症诱导的炎症

《RSC Chemical Biology》：Igalan attenuates sepsis-induced inflammation through covalent targeting of the NLRP3 inflammasome pathway

　　

巨噬细胞在脓毒症——一种危及生命的全身炎症综合征且其急需治疗干预——中发挥关键作用。遗憾的是，目前尚无获批药物靶向这一特定病理机制。本研究中，研究人员鉴定出天然化合物Igalan可选择性阻断巨噬介导的炎症级联反应。机制研究表明Igalan减轻氧化应激并维持线粒体完整性。关键的是，研究人员揭示Igalan共价修饰NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3)的NACHT结构域，从而不可逆地抑制炎症小体活化及随后的促炎信号转导。In vivo研究表明Igalan具有强效治疗作用，可减轻LPS(脂多糖)攻击斑马鱼中的全身炎症，并对小鼠脓毒症模型中的肺损伤和肠屏障功能障碍提供保护。综上，本研究确立Igalan为具有脓毒症治疗转化潜力的共价NLRP3抑制剂。

论文解读：Igalan通过共价靶向NLRP3炎症小体通路减轻脓毒症诱导的炎症

研究背景与意义

脓毒症是由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。目前针对脓毒症相关肺损伤的治疗手段（如皮质类固醇、TNF-α/IL-6靶向单抗）因全身性免疫抑制风险且生存获益有限而存在不足。巨噬细胞在脓毒症发病中起核心作用，NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3)炎症小体介导的巨噬细胞失调会促进致病性极化及全身炎症。NLRP3活化促进caspase-1活化、IL-1β(interleukin-1 beta)和IL-18成熟及GSDMD(gasdermin D)介导的细胞焦亡(pyroptosis)，加剧全身炎症与多器官功能障碍。因此，寻找可选择性调控巨噬细胞活化的新型NLRP3靶向药物具有重要临床转化价值。Igalan是旋覆花属(Inula species)植物中提取的倍半萜内酯(sesquiterpene lactone, SL)，传统用于抗炎，既往报道可激活Nrf2增强抗氧化能力及增强抗肿瘤免疫，但其对脓毒症炎症病理的抑制作用及机制不明。本研究由侯成辰(Chengchen Hou)、曾克武(Kewu Zeng)等开展并发表于《RSC Chemical Biology》，旨在明确Igalan对脓毒症炎症的抑制作用及其通过共价修饰NLRP3发挥抗炎症小体活化的分子机制。

主要关键技术方法

研究人员采用LPS刺激的小鼠永生化骨髓来源巨噬细胞(iBMDM)和RAW264.7细胞系进行体外抗炎评价；通过CCK-8检测细胞活力、Griess法检测NO(nitric oxide)释放、ELISA检测IL-1β/TNF-α/IL-6；用DCFH-DA和MitoSOX检测总/线粒体ROS(reactive oxygen species)，JC-1探针检测线粒体膜电位(ΔΨm)；Western blot检测NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β及GSDMD剪切情况。采用基于质谱的化学蛋白质组学(LC-MS/MS)鉴定Igalan共价修饰蛋白（搜索半胱氨酸上+232.15 Da质量偏移），结合KEGG/GO富集分析筛选靶标；利用Schr?dinger软件将Igalan与人NLRP3(PDB: 6NPY，补全缺失环区)进行共价对接(Michael加成)，锁定Cys704为修饰位点并经点突变(C704S)回补实验验证功能必要性。体内实验包括LPS诱导的斑马鱼全身炎症模型(检测ROS)及BALB/c小鼠LPS腹腔注射脓毒症模型(检测血清细胞因子、肺组织H&E染色与TNF-α免疫组化IHC、小肠H&E及ZO-1 IHC)。

研究结果

Igalan抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应

CCK-8确定Igalan在无显著毒性浓度范围内(≤25 μM)，以浓度依赖方式抑制LPS刺激的iBMDM和RAW264.7细胞NO释放，IC₅₀分别为174 nM(iBMDM)和779 nM(RAW264.7)。ELISA显示Igalan(0.5、1、2 μM)显著降低iBMDM上清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平。表明Igalan通过下调多种炎症介质发挥强效体外抗炎作用。

Igalan通过缓解氧化应激减轻LPS诱导的线粒体功能障碍

荧光探针检测发现Igalan浓度依赖性减少LPS刺激的iBMDM和RAW264.7中总ROS(DCFH-DA阳性)及线粒体超氧阴离子(MitoSOX阳性)。JC-1染色显示Igalan可逆转LPS引起的线粒体内膜去极化(降低绿色/红色荧光比值)，维持线粒体膜电位。表明Igalan抑制ROS过量产生，保护巨噬细胞线粒体功能完整性。

Igalan通过共价修饰NLRP3阻断炎症小体信号抑制巨噬细胞活化

化学蛋白质组学从iBMDM裂解液中鉴定出140个含半胱氨酸(+232.15 Da)的Igalan修饰蛋白，KEGG富集于NOD-like receptor signaling等通路，其中NLRP3被锁定为核心炎症相关靶标。分子对接与高分辨LC-MS/MS证实Igalan通过Michael加成共价结合人NLRP3 trLRR(transitional Leucine-Rich Repeat)结构域Cys704(小鼠对应Cys704)，且该修饰不伴随内酯开环水解(+250.33 Da)。Cys704位于连接NACHT与LRR结构域的界面，Igalan修饰后"锁定"构象，阻止NACHT结构域ATP水解依赖的构象变化，从而抑制NLRP3寡聚化、ASC募集、caspase-1活化、IL-1β成熟及GSDMD剪切——Western blot显示此抑制效果与经典NLRP3抑制剂MCC950相当。NLRP3 siRNA敲低后回补野生型(WT)可被Igalan抑制IL-1β分泌，回补C704S突变体则失效，证实Cys704共价修饰是功能必需。表明Igalan是共价NLRP3抑制剂。

Igalan抑制斑马鱼和小鼠脓毒症模型中的LPS诱导炎症

LPS处理斑马鱼引起全身ROS升高，Igalan(1、2、5 μg/mL)共处理显著抑制。BALB/c小鼠LPS(5 mg/kg,i.p.)脓毒症模型中，Igalan(5、10、20 mg/kg,i.p.，预处理及再给药)剂量依赖性降低血清IL-1β、TNF-α、IL-6，高剂量组效果与地塞米松相当。肺组织H&E示Igalan减轻单核/巨噬细胞浸润与出血；IHC示肺TNF-α表达降低。小肠H&E示Igalan减轻LPS致黏膜损伤、维持绒毛结构；IHC示肠上皮紧密连接蛋白ZO-1(zonula occludens-1)表达恢复。表明Igalan在体内有效缓解脓毒症相关肺损伤与肠屏障破坏。

讨论与结论翻译

讨论指出：脓毒症病理受NLRP3驱动，Igalan通过亲电Michael加成共价修饰Cys704，限制NACHT结构域ATP水解依赖构象变化，阻碍炎症小体组装。化学蛋白质组学显示高丰度核糖体等蛋白为无功能"亲核沉没"，低丰度NLR通路蛋白(如NLRP3)为功能关键靶标。Cys704修饰可能促使NLRP3暴露降解信号导致其蛋白水平略降。Igalan在不同巨噬细胞模型中IC₅₀差异源于RAW264.7缺乏ASC(PYCARD)无法组装经典NLRP3炎症小体，故核心机制实验选用ASC competent的iBMDM。未来需用生物素探针全面评估脱靶谱。

结论：本研究确定Igalan为具脓毒症治疗潜力的候选分子。其核心机制为共价修饰NLRP3 NACHT关联结构域Cys704，抑制NACHT ATP酶活性所驱动的构象改变，阻断炎症小体组装活化。本研究确立Igalan为靶向脓毒症核心炎症级联的共价NLRP3抑制剂。