《RSC Chemical Biology》：Mixed squaramide thioesters as phosphate group analogues for non-competitive antagonists of the phospholipid-sensing G protein-coupled receptor GPR55
编辑推荐：
高亲和力的特异性受体抑制剂是阐明细胞信号传导、调控生物系统以及开发治疗药物的重要工具。该研究报道了混合方酰胺硫酯作为一种新型亲电反应位点，证明其在水性环境中兼具亲核体可及性与水解稳定性的最佳平衡。密度泛函理论（DFT）计算表明，与混合方酰胺酯相比，混合方酰胺硫
高亲和力的特异性受体抑制剂是阐明细胞信号传导、调控生物系统以及开发治疗药物的重要工具。该研究报道了混合方酰胺硫酯作为一种新型亲电反应位点，证明其在水性环境中兼具亲核体可及性与水解稳定性的最佳平衡。密度泛函理论（DFT）计算表明，与混合方酰胺酯相比，混合方酰胺硫酯最低未占据分子轨道（LUMO）的能量更低，因此对亲核进攻表现出更高反应性。研究人员通过使混合方酰胺酯与相应硫醇缩合，便捷建立了多种将混合方酰胺硫酯作为磷酸生物电子等排体的溶血磷脂酰葡糖苷（LysoPtdGlc）类似物合成路线。随后，研究人员在原代培养伤害感受性神经元的轴突生长锥趋向性生物学实验中表征了这些类似物的抑制活性。这些合成类似物可诱导对GPR55/LysoPtdGlc信号传导的急性及持续性（超过12 h）抑制。该抑制作用导致GPR55介导的轴突趋向性发生持续性拮抗性减弱，同时保留生长锥对其他非GPR55依赖性趋向性信号分子的敏感性。上述发现表明，基于硫代方酰胺的磷酸生物电子等排体可作为具有良好反应性调控能力的高特异性抑制剂，从而拓展脂质感知型G蛋白偶联受体（GPCR）的调节剂库。
该论文发表于《RSC Chemical Biology》，围绕脂质感知型G蛋白偶联受体（GPCR）GPR55的高选择性持久性抑制展开。研究背景在于，GPR55广泛表达于神经系统、骨髓、淋巴组织、睾丸及胃肠道，并参与感觉回路发育、炎症反应、神经病理性疼痛及神经退行性过程。既往研究已证实内源性溶血磷脂酰-β-d-葡糖苷（LysoPtdGlc）是GPR55的高效配体，可通过LysoPtdGlc/GPR55/Gα
13/Rho/ROCK信号轴诱导伤害感受传入神经元的化学排斥。然而，尽管已有小分子激动剂、拮抗剂以及以方酰胺为磷酸生物电子等排体的竞争性类似物被开发，如何获得既具高特异性、又能实现持续抑制的非竞争性GPR55抑制剂，仍然是该领域的重要问题。传统共价抑制剂虽可通过邻近亲核残基形成稳定结合而实现持久抑制，但常面临水溶液中非特异反应与稳定性之间难以兼顾的矛盾。因此，研究人员开展本研究，旨在构建一种兼具水解稳定性与可控亲电性的磷酸基团类似物，并将其用于发展GPR55的持续性拮抗剂。
该研究的核心在于将混合方酰胺硫酯引入LysoPtdGlc类似物骨架，作为磷酸二酯生物电子等排体与潜在反应性位点。研究人员首先从理论层面评估其电子结构与构象适配性，继而建立两类先导化合物：I型化合物在方酰基与甘油片段之间引入硫酯键，II型化合物则在糖头基与方酰基之间引入硫酯键。随后，研究人员完成相应化合物的有机合成，并通过化学稳定性实验及原代感觉神经元生长锥转向实验，系统评估其化学反应特征与GPR55拮抗作用。研究结果表明，混合方酰胺硫酯相较对应酯类似物，具有更低的LUMO能级、更小的HOMO–LUMO能隙以及更高的热力学稳定性，提示其既有利于亲核进攻，又不易发生水解。生物学结果进一步显示，I型葡糖构型化合物可快速并持续抑制GPR55/LysoPtdGlc信号通路，表现出显著的非竞争性拮抗特征，而对应半乳糖差向异构体仅表现为较弱且可逆的竞争性拮抗，II型化合物则呈现较弱但可随时间增强的持续抑制作用。该研究的重要意义在于提出并验证了一类兼具结构模拟与反应调控特征的新型磷酸二酯类似物，为脂质感知型GPCR的精准化学调控提供了新策略，也为开发具有长期作用特征的受体抑制剂拓展了方法学基础。
在技术方法方面，研究人员主要采用以下几类关键方法：其一，利用密度泛函理论计算（DFT）与二级微扰理论（MP2）分析混合方酰胺酯/硫酯的前线分子轨道、相对自由能及构象空间，并结合同源建模与AutoDock分子对接评估化合物与GPR55关键赖氨酸残基的空间邻近性；其二，通过多步有机合成获得I型与II型LysoPtdGlc类似物及其差向异构体；其三，在水溶液中以封端赖氨酸模型底物考察其对赖氨酸Nε的反应性与水解稳定性；其四，采用内源表达GPR55的原代培养感觉神经元体外转向实验，评估化合物对etherLysoPtdGlc、LysoPtdIns及Sema3A诱导生长锥趋向反应的影响。样本来源为原代培养感觉神经元。
在“Results and discussion”部分，首先，“To assess the relative chemical reactivity of mixed squaramide esters and thioesters”一节通过DFT计算比较了混合方酰胺酯与混合方酰胺硫酯的电子结构。结果显示，混合方酰胺硫酯的HOMO–LUMO能隙更小，LUMO能量更低，说明其更易受到亲核进攻；同时其相对自由能低于相应酯类似物，提示其在水性环境下更稳定、不易水解。由此得出结论：混合方酰胺硫酯兼具较强亲电性与较高水解稳定性，适合作为靶向抑制剂中的反应性基团。
其次，“Following the selection of mixed squaramide thioester as electrophilic handle”一节聚焦两类先导结构的构象合理性。研究人员利用MP2水平计算比较I型与II型模型和磷酸二酯参照模型的空间相似性。结果表明，I型化合物存在与磷酸二酯低能构象较为接近的构象，仅需较小能量代价即可达到较高相似性，支持方酰胺骨架作为磷酸二酯生物电子等排体的适配性。相反，II型化合物的最低能构象与磷酸二酯偏差较大，若要达到更高相似度则需付出较高能量代价，因此其作为磷酸二酯模拟体的能力较弱。这一结果预示II型化合物的生物活性可能低于I型化合物。
随后，分子对接分析进一步指出，I型和II型化合物与GPR55同源模型中K80
2.60的Nε原子至亲电中心C
V的平均距离分别约为0.44 ± 0.05 nm和0.40 ± 0.06 nm，处于有利于发生亲核进攻的化学相关范围内。结合冷冻电镜（cryo-EM）结构中配体结合口袋具有高度柔性的认识，研究提示GPR55胞外区多个赖氨酸与精氨酸残基均可能成为作用位点。
在化学合成部分，“The synthetic access to Type 1 leads was established”一节报道了I型化合物的合成路线。研究人员以(S)–(?)–glycidol为起始原料，经伯醇保护、环氧开环、选择性活化、硫代乙酸钾取代、脱保护及与既往报道的葡糖构型方酰胺酯偶联，成功制得目标I型葡糖构型化合物，并进一步制得半乳糖构型同系物。核磁共振（NMR）分析表明，该类化合物存在可随温度变化的旋转异构体混合物。
在“To furnish the bridging thioester linking the carbohydrate head group with the squaryl moiety of Type 2 lead structures”一节，研究人员优化了II型化合物的合成。由于1-硫代葡萄糖亲核性较低，乙氧基离去基的底物与其在乙醇或二甲基亚砜（DMSO）中缩合均失败。通过将离去基替换为苯氧基，成功提高反应活性，最终在室温DMSO中获得目标II型化合物。该结果说明II型结构虽然可合成，但对反应底物活性要求更高。
在“To evaluate the susceptibility of mixed squaramide thioesters toward nucleophilic attack by lysine Nε and their hydrolytic stability”一节，研究人员考察了代表性化合物在水溶液中的反应性和稳定性。高效液相色谱（HPLC）分析显示，在中性pH下与封端赖氨酸模型底物共孵育24 h后，几乎不形成反应产物；即使延长至1周，起始物仍大部分保持完整。仅在pH 9.08的弱碱条件下，随着中性胺比例上升，才观察到少量至显著增加的产物生成。该结果表明，这类化合物在中性及弱碱环境中具有良好水解稳定性，同时在适当条件下保留对中性伯胺的反应能力。
在生物学部分，“The biological activity of , and were assessed”一节展示了I型葡糖构型化合物在原代感觉神经元中的活性。短时间浴式处理后，该化合物可有效抑制etherLysoPtdGlc诱导的排斥性趋向反应。更关键的是，经4 h脉冲处理、洗涤并在无药条件下培养13 h后，神经元仍对etherLysoPtdGlc失去响应，即使将诱导因子浓度提高2倍也不能恢复。与此同时，处理后的神经元对LysoPtdIns和Sema3A仍保有正常排斥反应，轴突延伸速率也保持健康。由此可见，该化合物引起的是快速且持久的GPR55非竞争性抑制，而非广泛毒性或对一般趋向机制的破坏。
在“Bath application of the galacto-configured homologue”一节，半乳糖构型差向异构体仅在短时处理时中度降低etherLysoPtdGlc诱导反应，而当诱导因子浓度加倍后抑制作用消失；脉冲处理后该效应也不再保留。研究据此认为，该化合物仅具有较弱的竞争性拮抗活性，且缺乏持久抑制能力。这与既往半乳糖头基类似物不能激活GPR55的结果一致，也支持抑制作用具有明确立体化学选择性。
在“Similar to , bath application of Type 2 lead compound”一节，II型化合物在短时浴式处理下同样表现出中等程度拮抗作用。与半乳糖差向异构体不同，II型化合物在脉冲处理后仍保留部分抑制效应，延长脉冲至8 h则可完全消除对etherLysoPtdGlc的响应。这表明II型化合物也能建立持续性非竞争性抑制，但效率明显低于I型葡糖构型化合物，与前述构象分析预测相一致。
讨论部分的核心在于，研究结果共同支持混合方酰胺硫酯既是有效的磷酸二酯生物电子等排体，又是具有可控反应性的亲电基团。I型葡糖构型化合物表现出的强效、持久、具有差向异构体依赖性的抑制，连同神经元对GPR55非依赖性引导信号的保留反应，排除了普遍细胞毒性、下游通路非特异损害或单纯残留化合物未洗净的解释。II型化合物的较弱活性则与其较差的磷酸构象模拟能力一致。整体而言，论文认为此类抑制更符合受体介导、对氨基或硫醇选择性的直接干扰机制，并最有可能涉及对GPR55信号传导的直接、潜在共价性干预。
研究结论部分可译为：高度特异且能够实现长期非竞争性靶标作用的抑制剂，是研究、治疗干预和诊断中的重要工具，因为其能够对生物学靶标进行精确调控。该研究证明，混合方酰胺硫酯可被合成并应用于生物体系，作为在水性环境中仍保留亲电性质的磷酸二酯生物电子等排体，兼具对氨基与硫醇官能团的亲核进攻敏感性以及显著的水解稳定性。I型和II型先导化合物均可通过方酰胺酯与相应硫醇缩合便捷获得。体外实验显示，它们在中性与弱碱条件下均具有较好稳定性，并在适当条件下可与赖氨酸ε-氨基发生反应。原代感觉神经元转向实验表明，I型先导化合物可对LysoPtdGlc/GPR55信号轴产生强烈且持久的抑制；相对地，其半乳糖差向异构体仅表现出中等且不持久的竞争性抑制；II型先导化合物则产生中等程度但可持续的非竞争性抑制。综合来看，混合方酰胺硫酯是一类兼具水性生物环境稳定性与对氨基、硫醇官能团亲电反应性的强效磷酸二酯生物电子等排体，具有广泛的生物大分子选择性靶向潜力。
