双酚F与双酚S对人脐动脉的内分泌干扰血管效应

《Journal of Xenobiotics》：Vascular Endocrine-Disrupting Effects of Bisphenol F and Bisphenol S on Human Umbilical Artery

　　

近年，双酚F（Bisphenol F, BPF）与双酚S（Bisphenol S, BPS）作为双酚A（Bisphenol A, BPA）的替代品被广泛应用于日常用品中，因BPA暴露被认为与多种疾病相关。然而近期研究提示BPA替代物也可能与心血管疾病等多种病理相关，其对人体健康的安全性受到质疑。因此，本研究旨在探究并比较BPA、BPF及BPS对人动脉张力的影响及其机制。结果表明，BPA、BPS和BPF对人脐带动脉及其平滑肌细胞产生非基因组（non?genomic）、内皮不依赖性的舒张效应。在基因组（genomic）效应方面，BPA、BPF和BPS通过干扰环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate, cGMP）信号通路及调节钙离子通道（Ca2+channels）活性，破坏人脐动脉（human umbilical artery, HUA）舒张的核心机制；且BPF比BPA和BPS更能改变血管舒张反应。综上，用BPF或BPS替代BPA似乎并未对人类心血管健康带来益处，未来应进一步评估此类双酚的血管效应，以明确其作用模式及对母胎健康的潜在影响。

研究背景与目的

双酚A（Bisphenol A, BPA）是广泛使用的工业化学品，可释放入食物并被人体吸收，作为内分泌干扰化学物质（endocrine?disrupting chemicals, EDCs）干扰激素作用，与心血管等多系统疾病相关。由于健康担忧，结构上类似的双酚F（Bisphenol F, BPF）和双酚S（Bisphenol S, BPS）被大量用作BPA替代品，但已有报道显示其在人体生物样本（包括母血、脐带血、胎盘）中被检出并可发生母胎转移，且潜在心血管毒性尚不清楚。为验证"BPA替代物更安全"这一假设，研究人员以人脐动脉（human umbilical artery, HUA）及原代人脐动脉平滑肌细胞（human umbilical artery smooth muscle cells, HUASMCs）为模型，考察BPA、BPF、BPS对非基因组（急性）和基因组（24?h孵育）水平血管舒缩功能及关键信号通路的影响，探讨其是否比BPA更具或更少心血管风险。本文发表于Journal of Xenobiotics。

主要关键技术方法

研究人员经葡萄牙科英布拉地方卫生单位伦理委员会批准，收集71例无病理性妊娠阴道分娩后的人脐带（human umbilical cord, HUC），分离HUA并制备去内皮血管环，及原代培养HUASMCs（至第5代以内）。主要技术包括：①离体器官浴（organ bath）实验检测HUA环在5?羟色胺（5?HT, 1?μM）或氯化钾（KCl, 60?mM）预收缩下，双酚直接（非基因组）加入或24?h孵育（基因组）后的张力变化，并以可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase, sGC）激动剂硝普钠（sodium nitroprusside, SNP）及L型钙通道（L?type Ca²⁺channels, LTCC/Ca_V1.2）拮抗剂硝苯地平（nifedipine, Nif）解析cGMP通路与Ca²⁺通道参与情况；②平面细胞表面积（Planar Cell Surface Area, PCSA）技术检测HUASMCs在5?HT诱导收缩后双酚直接作用或24?h孵育后SNP/Nif的作用；③四唑盐（3?(4,5?dimethylthiazol?2?yl)?2,5?diphenyltetrazolium bromide, MTT）法检测HUASMC活力；④实时荧光定量PCR（quantitative real?time PCR, qPCR）检测sGC与Ca_V1.2 mRNA表达。统计采用ANOVA及相应post hoc检验。

研究结果

3.1. Direct Vascular Effects of BPA, BPF and BPS on HUA

去内皮HUA环经5?HT或KCl预收缩后，累积加入BPA、BPF、BPS（0.002–100?μM），三者均引起浓度依赖性、内皮非依赖的血管舒张；BPF（自0.02?μM起）及BPS（部分高浓度）舒张效应强于BPA，BPF在100?μM时舒张最强。表明三种双酚均有急性非基因组血管舒张作用，且替代品效应不弱于甚至强于BPA。

3.2. Effects of Long?Term Exposure to BPA, BPF and BPS on the Contractility of HUA

HUA环经BPA、BPF、BPS（0.002、0.2、20?μM）24?h孵育后，5?HT诱导收缩中BPS与BPA反应有差异，KCl诱导收缩中仅BPS 0.2?μM与对照组有差异；BPF与BPA间无明显差异。提示长期暴露下BPA和BPS可轻微影响基础收缩能力，但BPF未显著改变基础收缩张力。

3.3. Effects of BPA, BPF and BPS on the cGMP Signaling Pathway of HUA

24?h孵育后给予SNP检测cGMP/sGC通路敏感性。结果显示双酚对SNP诱导舒张的影响具浓度、收缩剂及双酚种类依赖性：低浓度BPA（0.002、0.2?μM）可增强SNP舒张，高浓度BPA（20?μM）及多数BPS浓度减弱SNP最大舒张（尤100?μM SNP时），BPF低浓度增强而20?μM减弱SNP舒张。说明BPA、BPF、BPS可干扰cGMP信号通路，BPF呈双向调控，BPS倾向于抑制该通路。

3.4. Effects of BPA, BPF and BPS on the Activity of L?Type Ca²⁺Channels of HUA

24?h孵育后给予Nif检测LTCC参与情况。低浓度BPA和BPF（0.002?μM）增强Nif舒张，BPS高浓度（20?μM）亦增强Nif舒张；KCl预收缩下BPF 20?μM使Nif几近完全舒张（呈超敏），BPA部分浓度减弱Nif效应。表明双酚可调制LTCC功能，BPF 20?μM明显增强L型钙通道阻断剂的舒张潜能，提示其对Ca²⁺通道具显著影响。

3.5. Direct Vascular Effects of BPA, BPF and BPS on 5?HT?Induced Contractility of HUASMC

PCSA实验中，2?μM和20?μM BPA、BPF、BPS均使5?HT预收缩HUASMCs面积减小（即舒张），与离体血管环直接效应一致，且三者在细胞水平无显著差异。证实双酚直接舒张平滑肌细胞为非基因组、细胞自主性效应。

3.6. Genomic Effects of Exposure to BPA, BPF and BPS

HUASMCs 24?h孵育双酚后再予5?HT，收缩幅度与对照比无显著差异，但BPF与BPS组收缩反应较BPA组显著不同（p＝0.004、0.003）；予SNP（10?μM）各组反应无差异，予Nif（1?μM）时BPS组Nif舒张效应低于对照及BPA/BPF组。说明长期暴露下BPS可干扰LTCC相关舒张反应，BPF与BPS基因水平效应有别于BPA。

3.7. Cell Viability Studies (MTT)

BPA ≤200?μM、BPF和BPS ≤100?μM对HUASMC无显著细胞毒性；BPA 1000?μM、BPF 200/1000?μM、BPS 200/1000?μM显著降低存活率。表明功能实验所用浓度（≤100?μM）均在非细胞毒性范围，血管张力改变为特异性信号介导而非细胞死亡所致。

3.8. Gene Expression

qPCR显示BPA 2?μM显著降低Ca_V1.2 mRNA，BPA 0.002/0.2?μM及BPF 0.2?μM显著上调sGC mRNA，其余处理无统计学差异。提示BPA可下调L型钙通道转录、上调sGC转录，BPF部分浓度亦可上调sGC，与功能学发现相呼应。

讨论与结论总结

研究讨论指出，BPA替代品BPF、BPS同样具备急性内皮非依赖血管舒张且某些情况下更强；长期暴露可通过干扰cGMP/PKG通路及Ca²⁺通道（Ca_V1.2/LTCC）影响血管稳态，BPF呈非单调双向调控cGMP通路，BPS可削弱Nif诱导舒张暗示Ca²⁺稳态扰动。细胞毒性排除后确认上述为特异性信号效应。作者认为BPF与BPS作为BPA替代物未必更安全——尤其BPF在长期暴露下对HUA舒张机制的干扰甚于BPA，BPS亦存潜在钙通道相关基因组效应。呼吁开发更安全的替代品并开展混合暴露及内皮完整血管研究。

结论原文意译：本研究表明BPA及其替代品BPF、BPS改变HUA在动脉和组织水平的收缩反应。非基因组层面三者引起浓度依赖性短时舒张，替代品效应强于BPA；基因组层面BPA、BPF、BPS干扰HUA主要血管舒张通路——NO/sGC/cGMP/PKG通路及离子通道（激活/抑制）。长期BPF暴露比BPA和BPS更大程度改变HUA血管舒张反应。因此，用BPF或BPS替代BPA似未给血管健康带来益处，这些双酚尤其在妊娠等高敏感期可能调制血管反应，增加母胎发病及死亡风险。未来须继续评估此类EDCs血管效应以阐明其作用模式及对母胎健康的影响。