来源于月季白粉病菌(Podosphaera pannosa)菌寄生链格孢(Alternaria alternata) KMR13菌株的β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)基因家族的鉴定与表达分析

《Microorganisms》：Identification and Expression Analysis of the β-1,3-Glucanase Gene Family in the Mycoparasitic Alternaria alternata KMR13 from Rose Powdery Mildew

　　

β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)基因家族在真菌细胞壁降解中发挥重要作用，并与生防真菌的菌寄生(mycoparasitism)互作密切相关。本研究对菌寄生链格孢(Alternaria alternata)菌株KMR13中的β-1,3-葡聚糖酶基因家族进行了鉴定，并分析了其经蔷薇顶叉钩白粉菌(Podosphaera pannosa)孢子诱导后的表达模式，以探究Aag25基因在降解P. pannosa孢子中的作用。研究人员采用生物信息学方法从基因组中提取β-1,3-葡聚糖酶基因；根据P. pannosa孢子诱导下的基因表达水平，筛选、克隆并表达了可能参与菌寄生的GH17家族基因，纯化表达蛋白后测定了其酶活性及对P. pannosa孢子的破坏能力。结果在KMR13菌株中共鉴定到30个β-1,3-葡聚糖酶基因，包括18个GH16家族成员、8个GH17家族成员及GH64和GH81家族各2个成员。转录组分析显示其中23个基因在孢子诱导下有表达。基于差异表达分析，选取β-1,3-葡聚糖酶基因Aag25进行原核表达，成功诱导并纯化重组Aag25蛋白（约32.08 kDa），酶活力为1.464 U/mg蛋白。功能实验表明重组Aag25能有效破坏P. pannosa孢子细胞壁，导致孢子破裂及胞质渗漏。上述结果表明Aag25在KMR13菌株菌寄生过程中参与真菌细胞壁降解，并为开发靶向病原真菌的生物防治策略提供了潜在的酶资源。

《Microorganisms》刊载论文解读：链格孢(Alternaria alternata) KMR13菌株β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)基因家族鉴定及Aag25蛋白对月季白粉病菌孢子的降解作用

研究背景与意义

月季(Rosa chinensis Jacq.)是全球重要的观赏及药用植物，由专性活体营养真菌蔷薇顶叉钩白粉菌(Podosphaera pannosa)引起的月季白粉病是切花产业的主要障碍，严重威胁植株生长与经济价值。目前菌寄生(mycoparasitism)机制研究多集中于木霉属(Trichoderma)，链格孢属(Alternaria)作为常见植物内生及病原真菌，其某些菌株具备菌寄生潜力，但相关细胞璧降解酶——尤其是β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，水解真菌细胞壁主要骨架成分β-1,3-葡聚糖)基因家族的系统鉴定与功能验证尚不充分。真菌细胞壁含约80%多糖（β-葡聚糖、几丁质等），降解其β-1,3-葡聚糖可破坏渗透平衡致细胞裂解，是极具潜力的抗真菌策略。本研究以分离自P. pannosa的菌寄生链格孢(Alternaria alternata) KMR13菌株为对象，鉴定其全基因组β-1,3-葡聚糖酶基因家族，结合P. pannosa孢子诱导转录组筛选关键基因并验证功能，旨在阐明KMR13菌寄生生防机制，为生防制剂开发提供理论依据与酶资源。该论文发表于国际期刊《Microorganisms》。

主要关键技术方法

研究人员以保存的Alternaria alternata KMR13菌株及P. pannosa白粉病菌孢子为材料，主要技术方法如下：(1)基于Pfam、CDD及SMART数据库筛选并确认基因组中GH16/GH17/GH64/GH81糖苷水解酶家族β-1,3-葡聚糖酶基因，进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、基因结构、基序(motif)、染色体定位及启动子顺式作用元件预测；(2)P. pannosa灭活孢子壁诱导KMR13培养，转录组测序分析基因表达，RT-qPCR验证差异表达基因；(3)选取目标基因Aag25去除N端信号肽后克隆至pET-22b(+)载体，转化Escherichia coli Rosetta(DE3)经IPTG诱导原核表达，镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白并复性，SDS-PAGE及Western Blot鉴定；(4)葡萄糖标准曲线法测定重组Aag25酶活力（底物为β-1,3-葡聚糖，定义1 U为每毫克蛋白每小时产生1 mg还原糖）；(5)体外P. pannosa孢子与Aag25孵育，台盼蓝染色光镜观察孢子壁破损及胞质渗漏情况。

研究结果

3.1. Basic Physicochemical Properties, Signal Peptide, and Subcellular Localization Predictions（基本理化性质、信号肽及亚细胞定位预测）

经筛选，KMR13基因组共鉴定30个β-1,3-葡聚糖酶基因（命名为Aag1–Aag30），分属GH16家族18个、GH17家族8个、GH64家族2个、GH81家族2个。编码蛋白长270–1807 aa，分子量29.17–203.69 kDa，等电点pI 4.20–8.84（多数偏酸性）。16个含N端分泌信号肽，14个无；亚细胞定位于胞外(18)、质膜(5)、线粒体(4)、过氧化物酶体(2)，Aag1定位于细胞质；7个含跨膜结构域。

3.2. Gene Structure and Protein Motif Analysis（基因结构与蛋白基序分析）

所有成员含对应糖苷水解酶家族保守结构域，GH16主要含Motif 1/2/4/6，GH17主要含Motif 3/7/9，GH81含Motif 2/10，GH64无Motif 1–10。同一分支基序分布相似，暗示功能相近。基因含1–6个内含子、1–10个外on（Aag11含10个外显子最多，Aag9含6个内含子最多），10个基因无UTR区。

3.3. Chromosomal Localization and Prediction of Promoter Cis-Acting Elements（染色体定位与启动子顺式作用元件预测）

30个基因不均分布于10条染色体，无串联重复；两条染色体分别含5个和4个基因较多。启动子区共预测34种顺式元件，以激素响应（全部含MeJA与ABA响应元件）、光响应及生物钟相关为主，部分含胁迫响应元件；Aag8特含昼夜节律元件，Aag26含最多光响应元件。

3.4. Analysis of Target Gene Expression Induced by Spores of Podosphaera pannosa（蔷薇单丝壳菌孢子诱导下目标基因表达分析）

转录组显示30个基因中23个在诱导下有表达（7个未检出）。Aag25诱导24 h FPKM达436.09为最高，Aag10次之(229.92)。Aag3/Aag8/Aag10/Aag13/Aag14/Aag19/Aag26持续上调(0–96 h)；Aag4/Aag5/Aag25早期(0–24 h)上调、后期(48–96 h)下调；10个持续下调。RT-qPCR验证6个高表达/差异大基因，趋势与转录组一致，Aag5与Aag10分别上调12.66倍与32.68倍，峰值均在24 h，证实P. pannosa孢子壁可诱导β-1,3-葡聚糖酶基因表达。

3.5. Construction of the Recombinant Aag25 Protein Expression Vector（重组Aag25蛋白表达载体构建）

将去除信号肽的Aag25 CDS双酶切(NdeI/XhoI)连接pET-22b(+)，转化E. coli Rosetta(DE3)，质粒双酶切电泳出现~861 bp插入片段与~5367 bp载体条带，证明重组质粒pET22b-Aag25构建成功并经测序验证。

3.6. Expression and Purification of the Recombinant Aag25 Protein（重组Aag25蛋白的表达与纯化）

20 ℃、0.5 mM IPTG诱导6 h表达量最高，重组蛋白(~32.08 kDa)主要以包涵体形式存在于沉淀。超声破菌后取沉淀用变性缓冲液溶解，经Ni²⁺-琼糖凝胶亲和层析洗脱（50 mM及500 mM咪唑洗脱组分较纯），获得单一目标条带。

3.7. Validation of the Aag25 Protein（Aag25蛋白验证）

纯化蛋白SDS-PAGE显示~32 kDa处单一清晰条带；Western Blot以抗His标签单抗为一抗检出对应位置特异性条带，证实纯化为目标Aag25重组蛋白。

3.8. Enzymatic Activity of the Aag25 Protein and Its Destructive Effect on Spores of Podosphaera pannosa（Aag25蛋白酶活及其对P. pannosa孢子的破坏作用）

葡萄糖标准曲线R²=0.9987(y=0.9899x?0.0114)，计算得重组Aag25比酶活力为1.464 U/mg蛋白。P. pannosa孢子与Aag25共孵育，对照组孢子完整饱满；处理1 d即见个别孢子壁受损、台盼蓝着色，2 d受损增多，4 d多数孢子壁严重破裂、胞质明显渗漏并着色死亡，证实Aag25可降解P. pannosa孢子β-1,3-葡聚糖致细胞壁崩解。

讨论与结论总结

既往β-1,3-葡聚糖酶研究多见于木霉、芽孢杆菌等，Alternaria属相关研究较少。大肠杆菌原核表达虽易形成包涵体需复性，但操作简便适合初步功能验证。前人报道几丁质酶可直接致锈孢子壁变薄破裂，而部分β-1,3-葡聚糖酶(PKG1)仅引起胞内渗漏而壁形态完整；本研究中Aag25致P. pannosa孢子壁破裂，差异源于白粉病菌孢子壁β-1,3-葡聚糖暴露度高或加固组分少，更易被葡聚糖酶降解。几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶具协同抑菌效应，后续可筛选KMR13中GH18几丁质酶与Aag25联用评估增效作用。此外可优化表达条件或改用真核表达系统提升活性，深入解析菌寄生过程中细胞壁降解酶的互作机制。

结论翻译：研究人员在链格孢(Alternaria alternata) KMR13菌株基因组中共鉴定30个β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)基因，转录组显示其中23个在蔷薇顶叉钩白粉菌(Podosphaera pannosa)孢子诱导后有表达，7个于0–96 h持续上调，RT-qPCR证实所选基因显著诱导且24 h达峰，表明KMR13可能通过分泌β-1,3-葡聚糖酶等细胞壁降解酶破坏病原菌细胞壁引致胞质渗漏发挥生防作用。从中选取GH17家族基因Aag25进行功能分析，成功原核表达并纯化重组Aag25蛋白，酶活力1.464 U/mg蛋白，可明显破坏P. pannosa孢子细胞壁致胞质渗漏，提示Aag25参与KMR13菌寄生过程中的真菌细胞壁降解，在其生防机制中起重要作用。