嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）St 8.1的γ-氨基丁酸（GABA）合成及GABA生物合成关键基因转录调控的研究

《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》：GABA production by Streptococcus thermophilus St 8.1 and transcriptional regulation of the GABA biosynthesis key genes

　　

由于γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）对消费者具有公认的健康益处，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）产GABA的能力在乳制品工业中具有应用价值。嗜热链球菌中GABA操纵子（gadBC）的组成与结构虽已明确，但gadB（编码谷氨酸脱羧酶 glutamate decarboxylase, GadB）与gadC（编码谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向转运蛋白 glutamate/γ-aminobutyrate antiporter, GadC）在技术变量下的双重调控机制尚不清楚。本研究以嗜热链球菌St 8.1为对象，考察了模拟乳发酵及干酪成熟条件下，温度、pH、谷氨酸钠（monosodium glutamate, MSG）、NaCl及碳水化合物对其GABA产量及gadB、gadC基因转录水平的影响。研究人员采用定量反转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）评估发现，化学限定培养基（chemically defined medium, CDM）中添加MSG（CDMMSG）可差异上调gadB与gadC的表达；gadB转录随pH降至5.0以下于4~6 h开始增加，8 h达峰值（约8倍），而gadC呈双峰转录模式，分别于2 h（2.5倍，pH>5.0）和8 h（3倍，pH<5.0）出现峰值。此外，CDMMSG中添加NaCl可促进gad基因转录及GABA生成，添加乳糖则抑制其转录。结果表明gadB转录由低pH诱导，gadC可能受碳分解代谢物阻遏（carbon catabolite repression, CCR）调控，且在gadC起始密码子上游鉴定到保守的cre样序列。阐明gad基因调控机制有助于理性利用嗜热链球菌作为发酵剂生产GABA强化发酵乳制品。

嗜热链球菌St 8.1产γ-氨基丁酸（GABA）及其关键合成基因转录调控的论文解读

一、研究背景与立项依据

γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）是广泛存在于生物体内的非蛋白氨基酸，由谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase, GadB，由gadB编码）催化L-谷氨酸脱羧生成，同时需谷氨酸/GABA逆向转运蛋白（glutamate/γ-aminobutyrate antiporter, GadC，由gadC编码）将胞内GABA排出并摄入底物。乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）尤其是嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）因常用于发酵乳制品且能利用牛乳中丰富的谷氨酰胺/谷氨酸前体产GABA，被视为生产功能性GABA乳制品的理想发酵剂。尽管嗜热链球菌中GABA操纵子gadBC的结构已明确，且缺乏特异性转录调节因子GadR，但其gadB和gadC基因在不同工艺条件（如酸化、底物浓度、盐及碳水化物）下的差异化转录调控机制仍不清楚。明确这些基因的诱导与阻遏规律是优化菌株发酵性能、开发GABA强化乳制品的理论前提。因此，研究人员以从生牛乳分离的GABA产生菌株S. thermophilus St 8.1为材料，在模拟乳品加工条件下探究gadB和gadC的转录特征及环境因子对其的影响。该研究发表于《European Food Research and Technology》。

二、主要关键技术方法

研究人员选用从生牛乳分离的GABA产生株S. thermophilus St 8.1为供试菌株。采用丰富培养基M17（含/不含MSG）监测生长曲线、pH变化及GABA产量；采用改良Otto化学限定培养基（Chemically Defined Medium, CDM，含/不含10 mM MSG、1% NaCl或2%乳糖）进行基因转录分析。通过qRT-PCR（以glyS和gapdh为内参基因，2^?ΔΔCt法）定量gadB与gadC的相对转录水平；采用超高效液相色谱（Ultra-High Performance Liquid Chromatography, UHPLC）衍生化法检测GABA含量；通过in silico生物信息学分析GABA基因簇启动子、终止子及碳分解代谢物阻遏（Carbon Catabolite Repression, CCR）相关的cre位点。

三、研究结果

Growth dynamics, pH kinetics, and GABA production by S. thermophilus St 8.1（嗜热链球菌St 8.1的生长动态、pH动力学及GABA合成）

在LM17及LM17_MSG中培养，菌株呈典型三阶段生长（迟滞期0~2 h、对数期2~8 h、稳定期8~40 h），pH随生长下降。LM17_MSG中GABA于10 h（已达最低pH≈4.5后）开始检出，16~24 h达峰值（约6.6 mM），证实GABA大量合成滞后于酸化高峰，且外源MSG显著提升终产量。

Effect of culture conditions on GABA production by S. thermophilus St 8.1（培养条件对S. thermophilus St 8.1产GABA的影响）

在最适生长温42 °C下GABA产量最高；10 mM MSG时GABA/OD_{600 nm}比值最大，过高MSG无益；1%~2%乳糖或葡萄糖促进产量但机制不同；添加NaCl（0.5%~1.5%）显著降低单位密度GABA产量（在LM17体系中）；初始pH调至5.5时单位产量最高但生物量减半，初始pH 4.5不生长故无GABA。表明温度、MSG浓度、糖源、盐及初始pH均独立影响GABA合成效率。

Transcription of the GABA biosynthesis key genes（GABA生物合成关键基因的转录）

在CDM中仅有本底表达，CDM_MSG显著上调两基因。gadB转录4~6 h随pH<5.0升高，8 h达峰（约9倍），24 h仍上调；gadC呈双峰——2 h小幅上调（约2.5倍，pH>5.0早期），4 h回落，6~8 h二次上调（约3.5倍，pH<5.0）。添加1% NaCl促进6 h时gadB/gadC转录及后期GABA积累；添加2%乳糖显著抑制两基因转录（gadC甚至低于无MSG对照），导致GABA减产，提示乳糖介导CCR效应。

Transcriptional organization of the GABA cluster（GABA基因簇的转录组织）

生物信息学预测gadB和gadC各有独立-10/-35启动子，gadC起始密码子上游鉴定到cre样序列（5′-TGATTAACGATATGA-3′），gadC 5′端内含ρ-不依赖转录终止子（T2）。RT-qPCR显示gadC 5′区表达高于gadC本身而近似gadB水平，证明gadB与gadC分别转录为独立mRNA而非共转录多顺反子operon，属独立调控单元。

四、讨论与结论总结

讨论指出：St 8.1具短迟滞期与强酸化力，适合乳品发酵；GABA合成与低pH（≤5.0）偶联符合酸应激生存（acid stress response）假说。MSG是最低必需诱导物，最适浓度（10 mM）具菌株特异性。NaCl在CDM中促转录与GABA积累，可能是通过扰动跨膜质子动势激活应激响应，非直接酶激活。乳糖抑制gad基因转录并伴gadC上游cre位点，支持gadC受CcpA介导碳分解代谢物阻遏（CCR），该现象在LAB其他非中心代谢途径也有报道，需后续定点突变验证。gadB与gadC分属独立转录单元解释了二者差异化时相表达（gadB酸诱导、gadC早早期表达+CCR敏感）。

结论（翻译）：

本研究首次全面表征了嗜热链球菌GABA操纵子两组成基因的转录表达水平，揭示了乳品相关工艺参数（pH、温度、NaCl、碳水化合物）对GABA产量及gadB、gadC转录调控的潜在影响。简而言之，S. thermophilus St 8.1中GABA合成的关键酶基因gadB在低pH（≈5.0）条件下特异性诱导表达；NaCl可通过适度上调gadB与gadC转录促进GABA产量；gadC基因可能受乳糖介导的碳分解代谢物阻遏（CCR），并伴随GABA减产。尽管需在真实乳基质中验证，本研究建立的框架有助于理性选用嗜热链球菌作为发酵剂生产GABA强化发酵乳制品。