《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》：Influence of proline and methylglyoxal on the formation of 5-hydroxymethylfurfural in manuka honey
编辑推荐：
麦卢卡蜂蜜（Manuka honey），源自Leptospermum scoparium的花蜜，以其抗菌活性闻名，该活性归因于甲基乙二醛（methylglyoxal, MGO）的存在。与所有蜂蜜一样，麦卢卡蜂蜜必须符合法律规定，例如不得以影响成分或质量变化的方
麦卢卡蜂蜜（Manuka honey），源自Leptospermum scoparium的花蜜，以其抗菌活性闻名，该活性归因于甲基乙二醛（methylglyoxal, MGO）的存在。与所有蜂蜜一样，麦卢卡蜂蜜必须符合法律规定，例如不得以影响成分或质量变化的方式加热处理，且5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural, HMF）含量不得超过40 mg/kg。为研究MGO和脯氨酸（proline，蜂蜜中最丰富的氨基酸）对HMF形成的影响，研究人员制备了含有高达500 mg/kg MGO和高达1000 mg/kg脯氨酸的人工蜂蜜（artificial honey），以及添加MGO的真实蜂蜜（authentic honey），在37°C下储存10周，并通过高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）分析HMF及其前体3-脱氧葡萄糖酮（3-deoxyglucosone, 3-DG）的形成。对于添加MGO的真实蜂蜜和人工蜂蜜，HMF含量显著增加，取决于MGO的添加量。较高的MGO水平由于蜂蜜中较高的3-DG水平导致HMF形成增加。添加脯氨酸产生相反效果。观察到较低的HMF水平，尽管添加脯氨酸诱导了较高的3-DG水平，表明对3-DG转化为HMF的清除作用。基于这些发现，似乎有必要重新审查含MGO麦卢卡蜂蜜的当前40 mg/kg限制。
**研究背景、问题与研究目的**
麦卢卡蜂蜜（Manuka honey）来源于Leptospermum scoparium花蜜，因富含甲基乙二醛（MGO）而具有显著的非过氧化物抗菌活性，其MGO含量可达1541 mg/kg，远超其他蜂蜜（通常≤24 mg/kg）。然而，国际法规（如Codex Alimentarius）要求所有蜂蜜中5-羟甲基糠醛（HMF）含量不得超过40 mg/kg（热带蜂蜜为80 mg/kg），且蜂蜜不得因加热处理导致成分或酶活性改变。HMF由3-脱氧葡萄糖酮（3-DG）经脱水环化生成，3-DG则源于还原糖的焦糖化或美拉德反应。初步研究提示，麦卢卡蜂蜜可能无需加热即产生高于40 mg/kg的HMF，但具体影响因素尚不明确。除水含量、pH、金属离子外，MGO和蜂蜜中最丰富的游离氨基酸——脯氨酸，可能通过干预美拉德反应或焦糖化路径影响HMF形成。本研究旨在系统阐明MGO和脯氨酸对HMF形成的独立及交互作用，以评估现行40 mg/kg限量对含MGO麦卢卡蜂蜜的适用性，并为法规修订提供科学依据。
**研究内容、结论与意义**
研究人员制备了人工蜂蜜（44%果糖、37%葡萄糖、2%蔗糖、17%水，pH 5.0用葡萄糖酸调节）及四种市售真实蜂蜜（刺槐蜜、椴树蜜、油菜蜜、卡努卡蜜）。通过添加不同浓度MGO（0–500 mg/kg）和脯氨酸（0–1000 mg/kg），在37
°C下加速储存10周，利用HPLC-UV同步测定HMF和3-DG，并采用阳离子交换色谱-氨基酸分析仪定量游离脯氨酸。结果表明：MGO显著促进HMF形成（浓度依赖性），其机制与3-DG水平升高相关；脯氨酸反而降低HMF含量，尽管其升高3-DG水平（通过促进Amadori/Heyns产物生成），提示脯氨酸对3-DG向HMF转化具有清除效应（可能形成Schiff碱加合物）；当MGO与脯氨酸共存时，脯氨酸的抑制作用占主导，且MGO含量随时间下降（从500降至338 mg/kg），暗示两者直接反应。该研究首次揭示MGO和脯氨酸对麦卢卡蜂蜜HMF形成的拮抗作用，指出高HMF含量未必源于加热，可能是MGO自然转化的结果，因此建议将含MGO麦卢卡蜂蜜的HMF限量调整为80 mg/kg（类比热带蜂蜜），避免优质未加热蜂蜜被误判为“热加工”而丧失市场资格。论文发表在《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》。
**主要关键技术方法（不超过250字）**
研究人员使用以下方法：（1）HMF定量：10%（w/v）蜂蜜磷酸盐缓冲液（pH 6.5）膜过滤后，进HPLC-UV，C18柱（250×4.6 mm，5 μm），等度洗脱（84% 50 mM磷酸盐缓冲液pH 5.5 + 16%甲醇），流速0.8 mL/min，284 nm检测，外标校准（0.25–10 μg/mL）。（2）MGO与3-DG定量：500 μL蜂蜜溶液（10%）与150 μL 1%邻苯二胺（OPD）磷酸盐缓冲液避光衍生过夜，进HPLC-UV，C18柱，梯度洗脱（A: 0.075%乙酸水溶液，B: 20%A+80%甲醇），0.9 mL/min，30
°C，312 nm检测，外标校准（MGO: 0.6–30 μg/mL；3-DG: 0.81–16.2 μg/mL）。（3）脯氨酸定量：蜂蜜样品经阳离子交换树脂（AmberChrom 50WX8）富集游离氨基酸，7 M氨水洗脱，旋转蒸发、冻干后复溶于锂柠檬酸盐缓冲液，进氨基酸分析仪（Sykam S4300，LCA K07/Li柱，4.6×250 mm），茚三酮衍生，440 nm检测。样本队列为商业购买的刺槐蜜、椴树蜜、油菜蜜和卡努卡蜜。
**研究结果**
**1. 麦卢卡蜂蜜和含MGO模型蜂蜜中HMF的形成**
通过将四种真实蜂蜜（刺槐蜜、椴树蜜、油菜蜜、卡努卡蜜）添加MGO至500 mg/kg，37
°C储存10周后，所有蜂蜜HMF含量较未添加MGO时显著升高（增幅37%–126%），但不同蜂蜜增幅差异明显（如刺槐蜜HMF从2.9增至6.2 mg/kg，卡努卡蜜从15.9增至27.5 mg/kg），表明除MGO外其他成分（如脯氨酸、金属离子等）亦影响HMF积累。
**2. MGO对人工蜂蜜中HMF和3-DG水平的影响**
在人工蜂蜜中添加0–500 mg/kg MGO，HMF形成量随MGO升高而增加（空白46 mg/kg，500 mg/kg MGO时达74 mg/kg），且3-DG水平在储存10天后已显著升高，但HMF的显著增加仅在50天后出现。这表明37
°C下3-DG向HMF转化较慢（热力学控制），MGO通过促进3-DG生成间接提高HMF。
**3. 脯氨酸对人工蜂蜜中HMF和3-DG水平的影响**
添加0–1000 mg/kg脯氨酸后，HMF含量从空白46 mg/kg降至20 mg/kg（500和1000 mg/kg组），而3-DG从空白91 mg/kg升至最高201 mg/kg（1000 mg/kg脯氨酸组）。说明脯氨酸通过加速美拉德反应（生成Amadori产物）提高3-DG，同时通过清除HMF（可能形成Schiff碱）降低HMF净生成。
**4. MGO和脯氨酸对人工蜂蜜中HMF和3-DG水平的共同影响**
当同时添加1000 mg/kg脯氨酸和100–500 mg/kg MGO时，所有MGO组的HMF含量均低于无脯氨酸组，但仍高于空白（无MGO、无脯氨酸）。脯氨酸的抑制作用占主导，且MGO含量从初始500 mg/kg降至338 mg/kg，提示脯氨酸与MGO可能反应（如生成乙酰吡咯啉）。此外，真实蜂蜜中即使MGO调整至500 mg/kg且脯氨酸水平相近（刺槐蜜脯氨酸126 mg/kg，其余约210 mg/kg），HMF增幅仍不同，证实其他化合物（如多酚、金属离子）也参与调控。
**总结讨论与结论翻译**
讨论部分强调：MGO升高导致3-DG积累并转化为HMF，但此转化在常温下缓慢；脯氨酸通过竞争性清除HMF（可能形成Schiff碱加合物）有效降低HMF含量，且其抑制作用强于MGO的促进作用。然而，真实蜂蜜中脯氨酸与MGO的交互作用不足以完全抵消其他因素（如差异氨基酸谱、多酚、金属离子）的影响，提示HMF形成是多因子协同的结果。研究结论如下：
“研究人员能够证明，蜂蜜中HMF含量除了其他因素外，明显取决于MGO含量。高于限量值40 mg/kg的HMF含量因此不一定归因于蜂蜜的加热处理。由于麦卢卡蜂蜜通常被归类为低酶蜂蜜，淀粉酶数值的测定意义不大，因此存在风险：HMF含量超过40 mg/kg的麦卢卡蜂蜜会被错误地归类为‘加热处理’而无法上市。研究人员认为有必要进行进一步系统性研究，采用更广泛的数据集和较低的温度，探究MGO及其他化合物对麦卢卡蜂蜜中HMF形成的影响，并检验是否可接受更高的HMF含量（例如80 mg/kg，类似于热带蜂蜜）在相关法规中。”
