姜黄素介导的光动力灭活对不锈钢表面副溶血性弧菌生物膜的清除作用：胞外多糖的氧化损伤与降解

《Current Research in Food Science》：Curcumin-Mediated Photodynamic Inactivation of Vibrio parahaemolyticus Biofilms on Stainless Steel: Oxidative Damage and Degradation of Exopolysaccharides

　　

副溶血性弧菌在不锈钢表面形成的生物膜对食品安全构成严重威胁。本研究以胞外聚合物（EPS）的关键组分——胞外多糖为靶点，探究了姜黄素介导的光动力灭活（PDI）的抗生物膜效能及其清除机制。结果表明，采用60 μM姜黄素联合9.17 J/cm²蓝光照射的PDI处理可清除超过60%的副溶血性弧菌生物膜，并杀灭5.0 log CFU/mL的细胞。如此显著的清除效果归因于PDI处理大幅切割了糖苷键并降低了胞外多糖的分子量，进而破坏了氢键网络结构。这些变化降低了EPS基质的疏水性、减少了粘附功并削弱了界面张力，导致生物膜的内聚稳定性和界面稳定性严重丧失。因此，PDI处理诱导了生物膜网络结构的破坏与碎裂，从而实现了上述生物量和固着细胞的高效削减。本研究阐明了以EPS关键组分为靶点的PDI抗生物膜机制，为开发高效的PDI技术提供了理论指导。

## 一、研究背景与问题提出

生物膜是由食源性致病菌在食品接触表面形成的结构化微生物群落，对食品安全和公众健康构成重大威胁。据统计，设备相关的生物膜污染已估计导致59%的食源性疾病暴发。这些群落被包裹在由微生物自身产生的胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）基质中，该基质构成了一个具有内聚性和保护性的三维支架结构，不仅介导细菌对接触表面的粘附，还能保护内部细胞抵御广泛的环境胁迫和抗菌剂作用。

副溶血性弧菌因其嗜盐特性及在水生环境中的高流行率，在海鲜加工领域备受关注，其在水产品中的检出率高达35%–70%。该菌在不锈钢表面形成 robust 生物膜的能力造成了持续的交叉污染风险。与浮游细胞相比，副溶血性弧菌的生物膜形成不仅促进细菌在营养匮乏、干燥和低温条件下的存活，还赋予其对工业消毒剂的强耐受性。这种顽固性主要源于EPS基质的复杂结构和理化性质，该基质作为扩散屏障可中和活性试剂，并对内部细胞形成物理屏蔽。因此，传统的卫生规程（化学消毒结合机械清洗）在清除生物膜方面效果有限，凸显了开发替代性高效抗生物膜方法的迫切需求。

光动力灭活（photodynamic inactivation, PDI）作为一种前景广阔的非热杀菌技术，已在食品工业中崭露头角。其作用机制依赖于非毒性光敏剂在光和氧气存在下产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），包括单线态氧（¹O₂）、羟基自由基（•OH）等，这些高活性分子对微生物脂质、蛋白质和核酸造成非选择性氧化损伤，最终导致细胞死亡。目前，PDI的生物膜清除和杀菌效果已得到充分证实，其中姜黄素介导的PDI已被证明可显著减少副溶血性弧菌生物膜生物量超过70%，并明显降低胞外多糖含量。然而，ROS介导的EPS组分损伤与成熟生物膜解体之间的内在关系尚不清楚。

EPS基质并非均质无定形的粘液，而是一种高度有序的水合复合聚合物，其功能完整性对于维持生物膜稳定性、细胞间内聚力和环境胁迫抗性至关重要。EPS主要由胞外多糖、蛋白质、胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）和脂质组成，其中胞外多糖通常占干重的40%–95%。作为生物膜的主要三维结构支架，高分子量胞外多糖由通过糖苷键连接的重复单糖单元组成，通过氢键和疏水作用形成粘性凝胶状网络，从而增强EPS基质的刚性和结构稳定性。因此，靶向胞外多糖组分是一种科学合理且具有战略意义的生物膜清除策略。本研究旨在揭示姜黄素介导的PDI清除成熟副溶血性弧菌生物膜的机制，重点关注胞外多糖的分子结构和功能。

## 二、关键技术方法

本研究采用上海海洋大学实验室保藏的4株临床分离株（VP17、VP36、VP49、VP17802，源自粪便样本）构建混合菌株生物膜以模拟实际食品环境中的微生物多样性。生物膜在含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，于25°C下在不锈钢试片表面静态培养36小时至成熟。PDI处理采用455–460 nm蓝光发光二极管（LED，功率密度5.09 mW/cm²）作为光源，姜黄素为光敏剂。

研究主要涉及以下关键技术：结晶紫染色法用于生物膜生物量定量；菌落计数法（CFU/mL）评估细胞活力；MTT比色法测定细胞代谢活性；碘化丙啶（PI）染色结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察死/活细胞分布；超声破碎分离EPS后，采用苯酚-硫酸法定量胞外多糖；通过接触角测量仪测定接触角，运用杨氏方程计算粘附功，采用悬滴法测定界面张力；胞外多糖经乙醇沉淀、蛋白酶K消化去除蛋白质核酸杂质、透析和冻干后，利用凝胶渗透色谱（GPC）分析分子量，高效液相色谱（HPLC）分析单糖组成，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和拉曼光谱分析化学结构 degradation，以及原子力显微镜（AFM）观察纳米形貌。

## 三、研究结果

### 3.1 姜黄素介导PDI对副溶血性弧菌生物膜的清除效能

生物膜生长曲线显示生物量在36小时达到峰值后于48小时下降，因此选择36小时作为成熟生物膜的实验时间点。当姜黄素浓度为60 μM、光剂量为9.17 J/cm²（30分钟）时，PDI处理使生物膜生物量OD₆₀₀降至0.36，固着细胞从初始7.6 log CFU/mL降至2.6 log CFU/mL。MTT检测显示细胞代谢活性OD₅₇₀从1.37降至0.28，降低约79.6%。PI染色CLSM图像显示该处理组红色荧光最广泛。值得注意的是，80 μM姜黄素处理效果略有下降，归因于姜黄素的聚集诱导猝灭（aggregation-caused quenching, ACQ）效应。而单独姜黄素或单独光照处理均未显著减少生物膜生物量。

### 3.2 EPS基质结构和功能特性的变化

CLSM观察显示，PDI处理（60 μM姜黄素，9.17 J/cm²）使生物膜表面从致密不规则的突起结构变为光滑，三维图像显示生物膜内部间隙显著扩大，荧光强度降至无法检测。ImageJ分析表明该处理使生物膜孔隙率增至83%。接触角从空白对照的58.68°显著升高至84.27°，表明EPS基质疏水性降低；粘附功从111.7 J/m²降至89.8 J/m²；初始界面张力从约27.6 mN/m降至15.1 mN/m。这些理化性质的 concurrent 变化共同验证了生物膜网络结构的破坏与碎裂，导致内聚稳定性和界面稳定性的严重丧失。

### 3.3 PDI诱导胞外多糖结构和功能的改变

PDI处理同时降低生物膜生物量和胞外多糖含量，二者呈强正线性相关（R²=0.999, P<0.001），支持胞外多糖作为EPS基质结构支架的作用。反向补充实验显示，外源添加胞外多糖（0–100 μg/mL）剂量依赖性地减弱了PDI的清除效能，证实胞外多糖是PDI的关键分子靶点。

GPC分析显示，PDI处理使胞外多糖的超高分子量组分大幅下降，Z均分子量（Mz）从约22,481 kDa降至约9,916 kDa，同时数均分子量（Mn）和重均分子量（Mw）升高，多分散指数从8.48降至6.29，表明ROS优先切割较大聚合物链并可能引发交联反应。单糖组成分析显示总糖含量从249.71 μg/mg显著增至422.61 μg/mg（约69%），但关键结构单糖甘露糖（Man）、氨基糖（GalN、GlcN）和葡萄糖醛酸（GlcUA）的摩尔比例下降，提示生物合成通量发生重定向，损害了维持生物膜机械稳定性和基质内聚力的功能组分。

AFM显示PDI处理使胞外多糖从连续致密网络转变为破碎、分散、孤立的簇状结构。FT-IR光谱中，3424 cm^-1处O-H伸缩振动减弱表明氢键网络破坏；1079 cm^-1处糖苷键（C-O-C）伸缩振动强度降低并伴随波数位移；910 cm^-1处特征峰消失，新出现822 cm^-1峰提示α-糖苷键残留，表明糖苷骨干发生断裂。拉曼光谱中1160 cm^-1处糖苷键振动特征峰显著衰减，进一步证实糖苷键的切割。

## 四、讨论与结论

本研究系统阐明了姜黄素介导的PDI通过靶向胞外多糖清除副溶血性弧菌生物膜的分子机制。ROS首先攻击EPS基质中的胞外多糖骨架，导致糖苷键断裂、氢键网络破坏和单糖组成改变。这些分子修饰破坏了生物膜基质的结构 backbone，进而损害其理化完整性，表现为表面疏水性降低、粘附能减弱和界面稳定性受损。最终，生物膜结构发生解体，以孔隙率升高和组织松散化为特征，导致细菌广泛死亡。该研究在清洁不锈钢试片上进行，为食品工业中生物膜的绿色高效控制提供了重要的技术见解和理论支持。姜黄素介导的PDI代表了一种有前景的非热、环保型生物膜控制策略。

## 五、研究结论翻译

本研究证明，姜黄素介导的光动力灭活（PDI）能有效清除不锈钢表面的副溶血性弧菌生物膜。抗生物膜活性源于光照产生的活性氧（ROS）所触发的层级级联反应。ROS最初靶向EPS基质内的胞外多糖骨架，导致糖苷键断裂、氢键网络破坏和单糖谱改变。这些分子修饰破坏了生物膜基质的结构 backbone，从而损害其理化完整性，表现为表面疏水性降低、粘附能减弱和界面稳定性受损。结果，生物膜结构发生解体，以孔隙率升高和组织松散化为特征，最终导致细菌广泛死亡。值得注意的是，本研究是在清洁不锈钢试片上进行的。总体而言，姜黄素介导的PDI代表了食品工业中生物膜控制的一种有前景的非热、环保策略。