以氢乙醇混合物作为助溶剂/悬浮介质的超临界CO2提取植物生物活性成分。2. 卡拉法特浆果（Berberis microphilla G. Forst.）多酚的案例研究

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Supercritical CO2 extraction of plant bioactives using hydroethanolic mixtures as cosolvent/suspension medium. 2. Case study of calafate (Berberis microphilla G. Forst.) berry phenolics

　　

Laura M. Cuéllar|Cristian Moreno|Esteban Narváez|José Manuel del Valle|Zamantha Escobedo-Avellaneda|Gonzalo A. Nú?ez

智利圣地亚哥，智利天主教大学化学与生物工艺工程系

摘要

随着对天然产物需求的增加，人们致力于开发更具选择性且可持续的提取方法。本研究探讨了利用经乙醇水溶液改性的超临界二氧化碳从小叶黄连莓中提取生物活性成分的方法。在以富含二氧化碳的气相与富含水的液相达到平衡的两相条件下，分别研究了填充床和悬浮两种基质输送方式。提取在40或70℃、20或30MPa的条件下进行，其中液相中的水分含量以无二氧化碳基准计算分别为35%、45%或85%。在含35%水分的条件下，填充床法获得的总固体回收率最高，为常规提取方法的30.6%。而悬浮法在40℃和30MPa、含35%水分的条件下能得到最高的总多酚产量，所得提取物浓度最高，为每克干基质18毫克GAE。在含85%水分的条件下，悬浮法能最大程度地回收花青素，因为这种条件更有利于这些高极性化合物的溶解。这些研究结果表明，在通过改性剂辅助的两相超临界二氧化碳提取生物活性成分的过程中，进料方式和水分含量对提取选择性有着决定性影响。

引言

由于多酚类天然生物活性化合物具有益于健康的功效，且在食品、药品和营养品领域有广泛的应用前景，因此人们越来越关注这类化合物的分离提取。来自巴塔哥尼亚地区的本土浆果（Brito等人，2014年；Ramírez等人，2015年；Ruiz等人，2010年），尤其是小叶黄连莓，因其含有丰富的多酚类物质而备受瞩目，这类多酚包括花青素，它们不仅赋予浆果强烈的红色到紫色，还具备抗氧化作用（Olivares-Caro等人，2020年；Schmeda-Hirschmann等人，2019年）。Schmeda-Hirschmann等人（2019年）对源自巴塔哥尼亚浆果的生物活性化合物进行了跨学科研究，重点分析了人类对这些浆果的传统和文化用途，旨在进一步了解它们的药用特性和药理作用。从植物基质中提取多酚，比如从小叶黄连莓中提取花青素，仍然是一项重大挑战，因为需要采用具有选择性、可持续性且高效的方法来保留这些化合物的化学性质。

从环境和产品质量的角度来看，超临界二氧化碳提取技术作为一种替代传统有机溶剂提取亲脂性化合物的方法，逐渐显现出优势。由于其临界温度适中，且溶剂强度可调节，超临界二氧化碳能够选择性地提取热不稳定化合物，同时减少溶剂残留（Pereira & Meireles，2010年）。然而，纯超临界二氧化碳对花青素等极性溶质的亲和力较低。针对巴塔哥尼亚浆果，Ortiz-Viedma等人（2023年）开发了一种连续生物精炼工艺，第一步专门用于提取亲脂性化合物（油脂和生育酚），并未涉及花青素的提取，这间接体现了纯超临界二氧化碳在处理高极性酚类化合物时的局限性。实际上，Ortiz-Viedma等人（2023年）所采用的连续工艺的第二步，则是在室温下使用乙醇和水按1:1体积比混合的加压液体萃取法来提取酚类化合物。

为克服超临界二氧化碳在提取花青素方面的缺陷，人们开始使用乙醇、水或其混合物等极性共溶剂，以提高极性和/或高分子量化合物的溶解度，从而促进物质传递（Herrero等人，2010年；Pereira & Meireles，2010年；Reverchon & de Marco，2006年）。尤其有一些研究者探索了将乙醇水溶液作为二氧化碳的改性剂来提取植物花青素（见表1）。在特定的温度和压力条件下，二氧化碳、乙醇和水混合后可能会发生相分离，形成由富含二氧化碳的超临界相和富含水的液相组成的两相系统（Seabra等人，2010年；Kühn & Temelli，2017年；Arias等人，2023年；Mamani等人，2025年；Mamani, González等人，2026年）。当水溶解在二氧化碳和乙醇的混合液中时，会与二氧化碳反应，原位生成碳酸，从而降低系统的pH值（Toews等人，1995年）。这一过程会使花青素分子等阳离子发生质子化，提高其在三元混合液中的溶解度（Idham等人，2022年；Kühn & Temelli，2017年；Seabra等人，2010年；Yavuz-Düzgün & ?z?elik，2023年）。此外，这样的酸性环境对于保持花青素处于稳定的黄素阳离子形态也至关重要，可避免其在中性或碱性环境中降解为无色的醇假碱或棕色的降解产物（Enaru等人，2021年）。而在二氧化碳和水的两相混合液中，乙醇则起到增溶作用，能够帮助形成一种含有二氧化碳的溶剂液体介质，而这种介质仅靠水是无法形成的。因此，乙醇和水作为共溶剂组合的使用，能够同时解决单独使用任一成分都无法解决的溶解度和稳定性问题。三元（二氧化碳+乙醇+水）系统在改善溶质分配以及促进从植物基质中选择性提取生物活性化合物方面展现出潜力（见表1）。

本文的核心假设是，含有二氧化碳的膨胀液相有助于从完全破碎的植物组织中提取生物活性化合物。为此，我们采用了由富含水的二氧化碳膨胀液相和富含二氧化碳的乙醇水溶液改性气相组成的两相提取系统，这种系统形成了悬浮状态，我们将其称为“悬浮提取模式”。在这种两相系统中，溶质首先被提取到与基质接触的液相中，然后再转移到超临界相中进行传输和分离，这是一种两步物质传递机制（del Valle等人，2019年）。而“填充床提取模式”则是让粗磨后的植物组织在同样的乙醇水溶液改性二氧化碳气相中进行分析提取，不设置额外的液相。这样一来，物质传递就仅限于溶质直接穿过固体基质填充床进入超临界相。为了防止出现常见的结块现象，需要对植物基质进行粗磨处理，因为在用细磨过的基质进行填充床提取时很容易出现结块问题（Mamani, González等人，2026年）。Mamani, González等人（2026年）在本文的第一部分首次测试了这一假设，研究对象是红三叶草异黄酮的提取。与必须分批进行的填充床提取不同，将两相提取系统应用于在受控条件下的悬浮体系，可以在逆流接触柱中实现连续提取（Mamani等人，2025年）。除了共溶剂组成和操作条件外，悬浮提取的效果还很大程度上取决于植物基质和目标溶质。本文的创新之处在于将悬浮提取模式应用于从智利和阿根廷境内的富含花青素的巴塔哥尼亚浆果中提取目标成分。与红三叶草中的异黄酮不同，花青素分子在提取介质中可以被质子化，从而更容易在改性超临界二氧化碳中溶解，进而充分发挥悬浮提取模式的优势。

本研究旨在评估使用乙醇水溶液改性的超临界二氧化碳作为共溶剂和悬浮介质从小叶黄连莓中提取酚类化合物的效果。我们特别关注在与提取相关的条件下稳定两相溶剂系统的形成，并依据Mamani等人（2025年）提出的方法对这类系统进行了实验分析。在超临界相组成相同的条件下，我们系统地比较了填充床和悬浮两种进料策略在提取产量以及提取物的总酚含量、花青素浓度和抗氧化活性方面的差异。本研究旨在探究基质与溶剂混合物之间的相行为和接触方式如何影响提取过程的效率和选择性。

章节节选

基质

位于智利蓬塔阿雷纳斯的Secretos de la Patagonia机构提供了2022年2月至4月间采集的新鲜小叶黄连莓。这些浆果被储存在温度为-18℃的冷冻柜中。之后，这些冷冻浆果使用位于美国密苏里州堪萨斯城的Labconco FreeZone? 12-l冷冻干燥机在0.04毫巴的压力下进行冷冻干燥。干燥完成后，小叶黄连莓被粗磨，并通过1毫米筛网过滤，以便去除果肉和果皮中的种子。最终得到的就是经过干燥、研磨且按粒度分类的样品。

结果

以干基计，使用含有20%乙醇的酸化乙醇水溶液提取后，小叶黄连莓粉末中含有621.8毫克/克的可提取化合物。其中，每克干基的GAE含量为23.7±1.0毫克，C3G含量为451±14毫克/克。在通过对乙醇水提取物进行高效液相色谱分析后发现，这些化合物占所有检测到的花青素总量的3.14±0.04%。该提取物具备一定的抗氧化活性，使用ABTS试验测得其抗氧化活性为38.4±0.3微摩尔/克干基，而使用其他方法测得的数值为19.0±0.5微摩尔/克干基。

讨论

当使用乙醇水溶液改性的超临界二氧化碳作为提取溶剂时，尤其是采用悬浮提取而非相同溶剂混合物的填充床提取方式时，C3G的提取选择性有了显著且一致的提升（见表4）。在40℃和30MPa的条件下，当悬浮的二氧化碳膨胀乙醇水溶液中的水分含量从35%增加到85%（以无二氧化碳基准计算）时，提取选择性也会随之提高（见表4）。当二氧化碳溶解在水中时，

结论

我们的研究结果表明，相组成对高价值多酚的选择性提取起着关键作用。我们发现，采用悬浮提取是一种有效的策略，它不仅能提高总多酚的提取选择性（在填充床提取中，每克提取固体对应的GAE含量为2.0–9.3毫克，而在悬浮提取中则为1.4–8.7毫克），还能提高花青素的提取选择性（在填充床提取中，每克提取固体对应的C3G含量为0.05–1.34毫克，而在悬浮提取中则为0.02–1.22毫克）。悬浮提取

CRediT作者贡献说明

Laura M. Cuéllar：撰写——初稿撰写、验证、方法设计、正式分析、数据整理。 Cristian Moreno：方法设计、实验研究。 Esteban Narváez：方法设计、实验研究。 José Manuel del Valle：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化处理、监督工作、资源协调、项目管理、资金申请、正式分析、概念构思。 Zamantha Escobedo-Avellaneda：撰写——审稿与编辑、监督工作、资源协调、项目管理，

未引用参考文献

Mamani, Escobedo-Avellaneda和del Valle，2026年

Mutavski等人，2025年

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了智利国家研究与发展局（ANID）的资助，具体项目包括Fondecyt项目（编号1221451，由JMdV负责），以及智利博士奖学金计划/2023年度项目（编号1231348，由LMC负责）。LMC还要感谢智利天主教大学的研究副校长办公室（VRI-UC）提供的助研奖学金项目。此外，作者们还要感谢药物与食品研究实验室（LIFA）通过Fondequip项目EQY 220018为HPLC分析工作提供的支持。