逆转折叠：聚阴离子大环化合物溶解αA66–80晶状体蛋白肽聚集体

《Biomacromolecules》：Reversing the Fold: Polyanionic Macrocycle Dissolves αA66–80 Crystallin Peptide Aggregates

　　

白内障是世界范围内失明的主要原因，尚无明确的药物治疗方法。研究人员合成并研究了一种八磺化聚阴离子间苯二酚杯芳烃MR-8S（octa-sulfonated polyanionic resorcinarene MR-8S）抑制αA66–80晶状体蛋白肽（αA66–80-Crystallin peptide）聚集的能力，该肽是参与白内障形成的αA晶状体蛋白（αA-Crystallin）的关键肽段。核磁共振（NMR）和等温滴定量热法（ITC）实验揭示了MR-8S与组成该肽的九个氨基酸以及该肽本身之间的强相互作用。ITC显示解离常数在1 nM至1000 μM之间。荧光聚集实验、动态光散射（DLS）实验和透射电子显微镜（TEM）图像表明，MR-8S在生理溶液中对αA66–80晶状体蛋白肽具有浓度依赖性的去聚集能力。在αA66–80晶状体蛋白肽与MR-8S的1:1当量下，αA66–80肽聚集体的平均粒径下降了近9倍（从13293 ± 1072 d.nm降至1483 ± 15 d.nm），低于先前报道的相同批次肽在类似浓度下的大环化合物。从TEM成像可见，与纯αA66–80晶状体蛋白肽相比，不同比例的MR-8S和αA66–80晶状体蛋白肽混合物产生了肽的纤维状聚集体。需要44 ± 1 μM的MR-8S才能分解50%的αA66–80肽聚集体，该浓度显著低于两种已报道的功能化间苯二酚杯芳烃的IC₅₀值，且是第三种大环化合物的两倍。分子动力学（MD）模拟进一步表明，αA66–80肽的聚集由核心疏水残基驱动，而MR-8S有效屏蔽了这些残基，从而抑制了肽聚集体的形成。在测试的四种聚离子间苯二酚杯芳烃中，MR-8S显示出最强的去聚集效果，突出了其作为开发抗白内障治疗药物分子支架的潜力。

白内障是全球导致失明的主要原因之一，目前除昂贵且不适的手术外无有效药物治疗，尤其在不发达地区可及性差。白内障的病理机制涉及αA晶状体蛋白（αA-Crystallin）与眼内其他蛋白聚集，堵塞晶状体导致视力下降乃至失明。随着年龄增长，αA晶状体蛋白浓度下降，产生低分子量肽（LMW）片段，其中αA66–80肽段在病变晶状体中显著升高，被证实驱动聚集并产生活性氧（ROS）。已有小分子（如阿司匹林、类黄酮、橙黄G）和羊毛甾醇等尝试抑制聚集，但效果欠佳，后者因水溶性差、晶状体穿透力不足而受限。间苯二酚杯芳烃（resorcinarene）等大环主体因能结合并改变生物客体性质，且合成简便成本低而受到关注。前期研究发现上缘四磺化间苯二酚杯芳烃（UR-4S）、下缘四磺化间苯二酚杯芳烃（LR-4S）和上缘N-苄基铵间苯二酚杯芳烃氯化盐（UR-4A）对αA66–80肽聚集有不同程度的去聚集作用，但效果有限。研究假设，结合上下缘磺酸基的八磺化间苯二酚杯芳烃（MR-8S）能增强与αA66–80肽的结合，实现更高效去聚集。论文发表在《Biomacromolecules》。

研究人员采用了合成化学、质谱（ESI-MS）、动态光散射（DLS）、ProteoStat荧光聚集实验、透射电子显微镜（TEM）、核磁共振（NMR）和等温滴定量热法（ITC）等实验方法，结合分子动力学（MD）模拟，从系统水平分析MR-8S对αA66–80肽的去聚集能力及机制。所有肽购自GenScript，未进一步纯化；间苯二酚杯芳烃按文献合成。DLS测量在10 mM Tris缓冲液（pH 7.4）及100%房水中进行，荧光实验使用ProteoStat染料，NMR和ITC分别用于定性和定量表征结合，MD模拟采用AMBER24软件包，使用ff19SB力场和TIP3P水模型，在0.15 M NaCl生理离子强度下进行，包括对二聚体、四聚体及1:1大环-肽复合物的模拟，以及MR-8S对预组装寡聚体的破坏模拟。

**3.1 质谱分析（Mass Spectrometry）**：ESI-MS（软电离质谱）证实了MR-8S与αA66–80肽在气相中形成复合物，观察到如m/z 1053.3174 [MR-8S+αA66-80+10H-8Na]^3-等信号，表明两者在溶液中稳定结合。

**3.2 动态光散射（Dynamic Light Scattering）**：DLS测量显示，纯αA66–80肽在缓冲液中孵育7天后平均粒径为13293 ± 1072 d.nm。随着MR-8S比例增加（0.2:1至10:1），粒径显著减小。1:1当量下平均粒径降至1483 ± 15 d.nm（缓冲液）和2118 ± 286 d.nm（100%房水），分别较纯肽降低约9倍和6倍，且低于相同条件下LR-4S（5681 ± 1184 d.nm）、UR-4S（4998 ± 596 d.nm）和UR-4A（2120 ± 101 d.nm）的对应值，证明MR-8S具有更优的去聚集能力。

**3.3 荧光聚集实验（Fluorescence Aggregation Assay）**：ProteoStat染料与β-折叠结构结合并增强荧光。纯肽聚集呈高荧光信号；加入MR-8S后，所有比例均显示浓度依赖性的荧光强度降低。1:1比例下荧光强度降低约5倍，聚集抑制率达约80%，10:1比例时接近完全抑制。通过归一化抑制响应计算得IC₅₀（使50%聚集体分解所需浓度）为44 ± 1 μM，显著低于UR-4S（203 μM）和UR-4A（418 μM），约为LR-4S（89 μM）的2倍，表明MR-8S的高效性。

**3.4 透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy）**：TEM成像显示，纯αA66–80肽形成长且缠绕的纤维状网络，类似淀粉样卷须。单独MR-8S仅显示稀疏弥散颗粒。在1:1当量混合样品中，纤维状聚集体显著减少，出现破碎短纤维和无定形电子密集聚集体，提示MR-8S干扰肽自组装，可能稳定非纤维中间体。

**3.5 核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance）**：¹H NMR实验监测MR-8S与αA66–80肽所有单个氨基酸及全肽的化学位移变化。所有中性氨基酸（Phe、Ile、Leu、Val）的质子在MR-8S存在下出现0.04-0.29 ppm的屏蔽效应，表明位于疏水空腔内；阳离子氨基酸（Lys、Arg、His）显示0.05-0.86 ppm的显著屏蔽，暗示与磺酸基的强静电及潜在的阳离子-π作用。带负电的Asp和极性Ser也分别有0.18和0.20 ppm位移。与全肽结合时，His（~8.5 ppm）和Phe（~7.2 ppm）的质子屏蔽达~0.19和~0.16 ppm，确认MR-8S与肽相互作用。

**3.6 等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry）**：ITC在310 K下测量MR-8S与各氨基酸及全肽的结合。所有结合均为焓和熵有利，呈现多位点结合模式。解离常数（K_d）显示对阳离子及疏水中性氨基酸（如Arg、Lys、Phe）结合极强（K_d1低至0.001 μM），对Asp、Ser等也有微摩尔级亲和。MR-8S与全肽的K_d1为0.001 μM，K_d2为0.825 μM，结合亲和力远高于报道的四磺化衍生物，说明八磺化增强了多价相互作用。

**3.7 计算研究：抑制αA66–80肽聚集的机制基础（Computational Studies: Mechanistic Basis for Preventing αA66-80 Crystallin Peptide Aggregation）**

**3.7.1 αA66–80肽聚集机制研究（Investigation of the αA66-80-Crystallin Peptide Aggregation Mechanism）**：MD模拟从αA晶状体蛋白晶体结构（PDB: 6T1R）提取单体，构建二聚体和四聚体。回旋半径（RoG）、溶剂可及表面积（SASA）和均方根涨落（RMSF）分析表明，核心疏水残基（F71–L75）在聚集过程中逐渐聚集于核心，减少溶剂暴露，形成稳定聚集体。线性相互作用能（lie）分析显示，核心疏水残基贡献主要的范德华稳定化，驱动肽自关联。

**3.7.2 间苯二酚杯芳烃-肽在聚集抑制中的相互作用（Resorcinarene-Peptide Interactions in Aggregation Inhibition）**：对UR-4S、LR-4S、MR-8S和UR-4A与αA66–80肽进行对接和100 ns MD模拟。RMSF及SASA分析表明，MR-8S持久遮蔽核心疏水残基（F71–L75），使核心SASA从单体的611.73 ± 18.10 ?2降至461.02 ± 24.38 ?2，降幅最大；UR-4A部分遮蔽（517.83 ± 28.40 ?2）；UR-4S和LR-4S作用较弱。lie分析确认MR-8S通过核心疏水残基的强范德华相互作用实现最优抑制，离子接触分析表明生理离子强度下Na⁺动态结合不影响其结合模式。

**3.7.3 MR-8S诱导的αA66–80肽聚集体破坏（MR-8S-Induced Disruption of αA66-80 Peptide Aggregates）**：对预组装的二聚体和四聚体与MR-8S进行300 ns MD模拟。RMSF和核心接触分析显示，MR-8S结合后，链间核心疏水接触被破坏，柔性增加，导致链B从二聚体和四聚体中逐渐解离。表明MR-8S不仅能抑制早期成核，还能破坏已形成的寡聚体稳定性。

讨论部分强调，综合实验与计算结果表明，MR-8S通过强效屏蔽核心疏水残基（F71–L75），破坏驱动聚集的关键疏水相互作用，从而发挥最优去聚集效果。其高水溶性和低IC₅₀（44 ± 1 μM）使其优于其他间苯二酚杯芳烃类似物。

**结论**：研究人员成功合成了具有八个磺酸基团的聚磺化间苯二酚杯芳烃MR-8S，其中四个位于下缘，四个位于上缘。¹H NMR和ITC结合研究表明，MR-8S与构成αA66–80晶状体蛋白肽的所有氨基酸以及该肽本身发生强烈相互作用。荧光聚集实验揭示了MR-8S对αA66–80晶状体蛋白肽的去聚集能力，且随MR-8S浓度增加而增强。IC₅₀（使50%聚集体分解所需的MR-8S浓度）的计算值为44 ± 1 μM，显著低于其他报道的间苯二酚杯芳烃类似物UR-4S和UR-4A，但比LR-4S高约2倍。同样，在1当量MR-8S存在下，DLS实验显示αA66–80晶状体蛋白肽聚集体的平均粒径几乎减少9倍，从13293 ± 1072 d.nm降至1483 ± 15 d.nm。TEM图像进一步证实，与纯αA66–80晶状体蛋白肽相比，MR-8S与αA66–80晶状体蛋白肽的混合物中纤维状聚集体更少。计算研究成功解释了实验观察结果。MD模拟显示，αA66–80的核心疏水残基（F71–L75）在聚集过程中发挥核心作用，这在二聚体和四聚体形成中均明显可见。在这些情况下，核心疏水残基聚集在一起以最小化与水接触，突出了其固有的疏水性质。RoG、SASA和RMSF分析进一步支持了这一行为。肽-间苯二酚杯芳烃复合物的MD模拟进一步阐明了它们的聚集抑制特性。在测试的间苯二酚杯芳烃中，MR-8S与核心疏水残基表现出最强的相互作用，有效屏蔽它们并防止聚集。比较RMSF和SASA分析强调，有效抑制与间苯二酚杯芳烃对肽核心疏水残基的屏蔽相关，使得MR-8S成为该系列中最有效的抑制剂。总体而言，计算研究提供了对αA66–80肽聚集及间苯二酚杯芳烃介导抑制机制的分子水平理解，为合理设计更有效的聚集抑制剂提供了有价值的指导。基于这些结果，MR-8S大环化合物及其强去聚集效应，可为开发抗白内障治疗药物的分子支架奠定基础。研究人员将继续探索此类大环化合物不仅对αA66–80晶状体蛋白肽，而且可能对αA晶状体蛋白的单链A，甚至对16聚体αA晶状体蛋白发挥去聚集作用的潜力。