通过工程化获取立构不规则(立构非规整)聚(3-羟基丁酸酯)微结构实现微生物源聚(3-羟基丁酸酯)[PHB, poly(3-hydroxybutyrate)]加工性能的改善

《Biomacromolecules》：Engineering Access to Stereoirregular Polymer Microstructures Enables Improved Processability of Microbial Poly(3-hydroxybutyrate)

　　

聚(3-羟基丁酸酯)[PHB, poly(3-hydroxybutyrate)]是一种生物相容且可生物降解的聚羟基脂肪酸酯(PHA, polyhydroxyalkanoate)，但其高度规整的立体微结构导致高结晶度与差劲的加工性。研究人员在此证明，可通过微生物生产立构不规则(stereoirregular)PHB，这挑战了严格PHA合酶(PhaC, PHA synthase)立体专一性使此类结构无法获取的观点。在概念验证研究中，研究人员生产出含6.84%±0.04%(S)-3-羟基丁酸酯[(S)-3-hydroxybutyrate]、m-二单元组(m-dyad)分数为11.8%±0.7%的立构不规则PHB。与常规PHB相比，该立构不规则材料熔点由179.3℃±0.7℃降至154.3℃±1.1℃，且加工过程中数均分子量(Mn, number-average molar mass)热分解减少。结果表明微生物合成可获得立体化学多样的PHB；重要的是，其证明生物合成聚合物可具备以往仅化学合成类似物才有的改善之加工性与可回收性。这些发现推翻了PHB生物合成中长期存在的假设，并为通过微生物工程在生物学层面调控聚合物微结构与性能提供了依据。

该研究发表于《Biomacromolecules》。以下为论文解读：

研究背景与意义

聚(3-羟基丁酸酯)[PHB, poly(3-hydroxybutyrate)]是典型的微生物源聚羟基脂肪酸酯(PHA, polyhydroxyalkanoate)，具备生物相容性和可生物降解性，是石油基塑料的潜在绿色替代材料。然而天然PHB为全(R)-等规(isotactic)立构结构，结晶度高、质脆，且熔点(~179℃)接近热分解温度，导致热加工时易发生分子链断裂、加工窗口窄、回收困难，严重限制了其工业应用。化学合成的立构不规则(atactic/syndiotactic)PHB可通过引入(S)-对映体降低结晶度和熔点从而改善加工性，但化学法不具微生物发酵的经济与分子量优势，且传统观点认为PHA合酶(PhaC)严格立体专一性只能聚合(R)-3-羟基丁酰辅酶A[(R)-3-hydroxybutyryl-CoA]，微生物无法合成立构不规则PHB。本研究假设PHA合酶未必绝对排除(S)-底物，若向胞内供给(S)-3-羟基丁酰辅酶A[(S)-3-hydroxybutyryl-CoA]，重组大肠杆菌(Escherichia coli)应能合成立构不规则PHB，据此开展概念验证研究，首次实现微生物合成含(S)-单体的立构不规则PHB并表征其材料性能。

主要关键技术方法

以Escherichia coli BW25113为底盘菌株，敲除脂肪酸β-氧化基因fadB与fadJ以阻止(S)-3-羟基丁酰-CoA降解；引入Clostridium kluyveri的(S)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶基因hbd以从乙酰-CoA生成(S)-3-羟基丁酰-CoA，共表达Cupriavidus necator来源的phaCAB（乙酰-CoA乙酰转移酶PhaA、乙酰乙酰-CoA还原酶PhaB、PHA合酶PhaC）及来自Chromobacterium sp. USM2、Allochromatium vinosum（PhaEC）等不同来源PhaC进行筛选；通过单质粒操纵子重排优化hbd与pha基因共表达；采用溶氧(DO)反馈控制的葡萄糖补料分批发酵放大培养；聚合物经氯仿提取，GC-FID测定(S)-3-羟基丁酸酯含量，¹³C NMR分析立构序列（racemo/meso二单元组分数），SEC-GPC测分子量分布，DSC与TGA分析热行为，模压制样后做拉伸试验评估力学性能。

研究结果

3.1. Strain and Metabolic Pathway Design（菌株与代谢途径设计）

研究人员在大肠杆菌中共表达phaA/phaB（产(R)-3-羟基丁酰-CoA）、来源于Clostridium kluyveri偏好NADPH的hbd（产(S)-3-羟基丁酰-CoA）及能聚合混合对映体底物的PhaC；敲除fadBΔfadJ阻断(S)-3-羟基丁酰-CoA被脂肪酸β-氧化复合体降解。结论：此代谢设计可为胞内提供(S)-单体前体并防止其无效循环消耗。

3.2. Identification of Non-Stereospecific PhaCs（非严格立体专一性PhaC的筛选）

将5种不同类别PhaC（I类CnPhaC、CsPhaC；III类AvPhaEC；IV类PmPhaRC；II类突变体PsPhaC1_STQK）分别与hbd共表达，在野生型及ΔfadBΔfadJ背景中检测聚合物中(S)-3-羟基丁酸酯含量。结果所有测试PhaC均能掺入(S)-单体，ΔfadBΔfadJ株显著提高(S)%-掺入量，其中AvPhaEC与CsPhaC产量最高。结论：多种PhaC并非严格排斥(S)-对映体底物，推翻PHA合酶绝对立体专一性传统认知；后续选用AvPhaEC体系。

3.3. Optimization and Characterization of Metabolic Pathways（代谢途径优化与表征）

将hbd整合至phaEC-phaAB操纵子不同位置（首、次末、末），在复合及葡萄糖基本培养基中测生长速率、PHB含量、(S)%及转录水平。hbd置于次末位置（AvPhaEC-CnPhaA-CkHbd-CnPhaB）获最高(S)-掺入（摇瓶最高达21%±5%），但PHB总产量较无hbd对照下降约1/3；(S)%与PHB含量呈负相关。稳态生长下该株生长率未受明显抑制，phaB转录略有上调。结论：操纵子重排可有效调控(S)-单体掺入比例，掺入增加伴随PHB通量降低，反映PhaC仍存在(R)偏好性及(S)-3-羟基丁酰-CoA积累影响辅因子平衡。

3.4. Upscaling and Production of Stereoirregular PHB（放大培养与立构不规则PHB生产）

采用DO-stat补料分批发酵比较等规PHB株（A：AvPhaEC-CnPhaAB）与立构不规则PHB株（B：含hbd操纵子）。B株生长后期停滞较早，PHB含量降至(0.046±0.002) g/g DCW（A株为0.443±0.002 g/g），胞外分泌17 g/L几乎纯(S)-3-羟基丁酸（由未知硫酯酶水解胞内(S)-3-羟基丁酰-CoA后排出），推测为细胞解除(S)-单体积累的解毒机制并导致生长抑制与PHB产率下降。纯化后立构不规则PHB含6.84%±0.04%(S)-3-羟基丁酸酯，m-二单元组分数11.8%±0.7%，符合Monte Carlo随机掺入预期。结论：成功在发酵规模获得微生物源立构不规则PHB，(S)-单体分泌是主要产率限制因素。

3.5. Structural, Thermal, and Mechanical Polymer Properties（聚合物结构、热学及力学性能）

SEC显示立构不规则PHB的M_n=(252±25) kg/mol、M_w=(704±64) kg/mol，多分散性降至2.8±0.2（等规株M_n≈369 kg/mol、M_w≈1590 kg/mol、?≈4.4）。DSC显示二次熔融峰T_m=154.3℃±1.1℃（等规179.3℃±0.7℃），结晶度降至39.1%（等规55.0%）。热压130℃制得透明薄膜（等规170℃压片为不透明），Young's模量约减半((0.6±0.1) GPa vs.(1.1±0.2) GPa)，断裂伸长率提升至10.5%±1.5%（等规4.8%±1.0%），断裂功增大，拉伸强度相当。等温加热处理中立构不规则PHB在150℃以下M_n仅降17%（等规170℃处理30 min降>50%）。结论：(S)-单体随机掺入降低结晶度与熔点，使加工温度降低并大幅减少热分解，韧性改善，更利于加工与再循环。

讨论与结论总结

研究人员指出微生物合成立构不规则PHB需两个条件——胞内存在(S)-3-羟基丁酰-CoA（由hbd提供）及PhaC可接受混合对映体底物（多数PhaC具备一定宽容度）。当前限制为PhaC仍偏好(R)-底物及hbd活性过高致(S)-单体过量积累引发分泌浪费，未来可通过筛选/改造低选择性PhaC及优化hbd表达水平改善。立构不规则PHB两对映体源自同一碳源（乙酰-CoA），比需双碳源的PHA共聚物工艺更简单。材料性质符合化学合成立构不规则PHB文献规律：随机(S)掺入扰乱晶区→降低ΔH_m、T_m、结晶速率→提高延展性、降低加工温度、减少热降解、潜在提升生物可降解性。研究结论如下：传统等规PHB因高结晶导致脆性及热加工时分子量衰减而限制应用，化学合成表明立构不规则结构可改善之但工业以微生物合成为主；本研究首次建立微生物合成立构不规则PHB的概念验证路线，所获聚合物具备化学合成类似物预示之改善加工性与可回收性；证明本被认为高立体专一的生物系统可被工程化以获取立体化学多样性，通过代谢工程调控单体池为从可再生原料温和条件下设计可持续聚合物材料结构–性能关系提供了新范式，可拓展至其他PHA及酶促聚合体系。