《Journal of Proteome Research》：Maximizing Lipidome Coverage of Mouse Liver Following the IV Administration of Gefitinib by Combining Both UHPLC-MS-Based Untargeted and Targeted Lipidomics
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对小鼠静脉注射（10 mg/kg）酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（gefitinib）后获得的肝脏提取物进行了非靶向（untargeted）“发现”和靶向（targeted）脂质分析，以最大化肝脏脂质组（lipidome）的覆盖率。通过反相超高效液相色谱-离子淌度-
对小鼠静脉注射（10 mg/kg）酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（gefitinib）后获得的肝脏提取物进行了非靶向（untargeted）“发现”和靶向（targeted）脂质分析，以最大化肝脏脂质组（lipidome）的覆盖率。通过反相超高效液相色谱-离子淌度-质谱（RP-UHPLC-IM-MS）在正（+ve）和负（-ve）电喷雾电离（ESI）模式下进行的非靶向脂质分析显示脂质谱的时间相关变化，包括磷脂酰胆碱（PCs）和磷脂酰乙醇胺（PEs）丰度降低以及溶血磷脂酰胆碱（LPCs）同时升高。通过亲水作用色谱-超高效液相色谱-质谱（HILIC-UHPLC-MS）在正ESI模式下进行的靶向分析也显示吉非替尼给药小鼠脂质谱的时间相关效应，涉及PCs、鞘磷脂（SMs）、甘油三酯（TGs）和LPCs，特别是脂质PC(34:1)、PC(32:1)、SM(40:1)、TG(48:1)和PC(32:0)，并且还注意到对多种酰基肉碱（acyl carnitines）的影响。此外，使用负ESI观察到对一系列脂质的时间相关效应，包括磷脂酰甘油（PGs）、PCs、溶血磷脂酰乙醇胺（LPEs）、PEs和游离脂肪酸（FFAs）。所得数据表明，暴露于吉非替尼可能导致小鼠肝脏中脂肪酸利用和代谢的广泛影响。
**论文解读文章**
**1. 研究背景**
吉非替尼（gefitinib）是一种酪氨酸激酶抑制剂（TKI），靶向表皮生长因子受体（EGFR），最初用于非小细胞肺癌的治疗。先前对小鼠静脉（IV）和口服（PO）给药后的药代动力学和代谢命运研究注意到，其对代谢组和脂质组产生了影响，且这些影响似乎与药物本身的血浆浓度高度相关。这些代谢物和脂质谱的变化可能突出可用于识别患者时间依赖性反应（或缺乏反应）并监测疗效的“生物标志物”，也可能提供药物作用模式（MOA）的见解，或揭示与所治疗疾病无关但可能在其他治疗领域有价值的生化反应，从而实现化合物的重新定位。此外，检测不必要的“脱靶”相互作用可能有助于早期识别潜在毒理效应。理解这些药代动力学和药脂组动力学效应有助于更全面地了解药物对患者的影响，从而辅助治疗策略和个体化用药的实施。在前期基于血浆的脂质组学研究中，研究人员观察到吉非替尼对小鼠溶血磷脂酰胆碱（LPCs）、磷脂酰乙醇胺（PEs）和磷脂酰胆碱（PCs）的药脂组动力学变化。为准备未来对吉非替尼及相关化合物的研究，研究人员以肝脏作为脂质生物合成的主要器官，旨在通过联合使用非靶向“发现”超高效液相色谱-离子淌度-质谱（UHPLC-IM-MS）方法和定量靶向亲水作用色谱-质谱（HILIC-MS/MS）方法，最大化肝脏脂质组覆盖率。
**2. 研究内容与结论**
研究人员对雄性C57Bl/6JRj小鼠（20–27 g）在静脉注射（IV）10 mg/kg吉非替尼后，于0.5、1、3、8和24小时时间点收集肝脏样本（每个时间点2只小鼠）。采用改良的有机溶剂提取法（二氯甲烷:甲醇）提取脂质，分别进行非靶向发现脂质组学分析和靶向定量脂质组学分析。非靶向分析使用反相UHPLC-IM-MS在正负电喷雾电离（ESI）模式下进行；靶向分析使用HILIC-MS/MS在正负ESI模式下进行，同时定量吉非替尼及其代谢物。数据分析包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以及变量重要性投影（VIP）评分。
结论：联合应用非靶向和靶向脂质组学方法揭示了吉非替尼对小鼠肝脏脂质组的广泛时间相关影响。非靶向分析显示PC和PE丰度降低，LPC丰度升高，提示可能通过Lands循环影响磷脂代谢。靶向分析定量了433种脂质，显示PC、SM、TG、LPC、FFA、PG、LPE、PE和酰基肉碱表现出复杂的时间轨迹，其中含C16:0棕榈酸的脂质（21/50）变化最为显著。药物浓度与脂质变化之间未观察到简单相关性，但代谢物M6（M537194）在3小时达到峰值，可能与部分脂质变化相关。
重要意义：本研究提供了一种最大化脂质组覆盖率的分析策略，揭示了吉非替尼可能的药脂组动力学效应，为理解TKI类药物的作用模式（MOA）和潜在脱靶效应提供了新视角。该研究发表在《Journal of Proteome Research》。
**3. 关键技术方法**
（1）使用反相超高效液相色谱-离子淌度-质谱（RP-UHPLC-IM-MS）进行非靶向脂质发现分析，结合正负ESI模式，通过Lipostar软件进行特征提取和鉴定，利用CCS库和LIPIDMAPS数据库进行高置信度脂质鉴定。（2）使用亲水作用色谱-串联质谱（HILIC-MS/MS）进行靶向定量脂质分析，采用“LipidQuan”方法，结合稳定同位素标记（SIL）内标和奇数链脂质混合物，监测433种脂质分析物，并使用TargetLynx和Skyline软件处理数据。（3）样本来源于Evotec SAS（法国图卢兹）进行的吉非替尼在雄性C57Bl/6JRj小鼠中的药代动力学研究，肝脏样本在IV给药后0.5、1、3、8、24小时采集。
**4. 研究结果**
**4.1 发现性非靶向RP-UHPLC-IM-MS脂质组学分析**
非靶向分析在正ESI和负ESI中分别检测到1544和1562个脂质特征，经严格筛选后分别鉴定出215和184个高置信度脂质（合并后共303种）。PLS-DA分析显示时间相关轨迹，0.5至24小时样本沿PC1和PC2分离。正ESI数据中VIP得分最高的25种脂质包括6种PC、13种TG、1种SM、1种PE、3种DG和1种PA；负ESI数据中包括10种神经酰胺（Cer）、5种PE、4种PC、1种PG、1种SM、1种FFA等。PC（如PC(34:1)和PC(36:4)）在给药后相对丰度降低，3小时达到最低，24小时回升；而LPC（如LPC(20:4)和LPC(18:2)）则相反，3至8小时升高，24小时降低，表明药物可能影响PC/LPC平衡。
**4.2 吉非替尼及其代谢物**
通过靶向HILIC-MS/MS测定肝脏提取物中吉非替尼浓度，0.5小时达最大浓度（约15000 ng/mL，对应约300 ng/mg组织），随后下降，8小时约3500 ng/mL，24小时约90 ng/mL。血浆与肝脏浓度呈相关性。代谢物O-去甲基吉非替尼（M523595）仅在0.5和1小时可检测且低于定量限；代谢物M3（吗啉环裂解并形成羧酸）和M6（M537194，吗啉环开环和部分降解）也被检出，其中M6在3小时达最大浓度。
**4.3 定量靶向脂质分析**
靶向分析监测433种分析物，正ESI检测203种，负ESI检测194种，38种双模式检测。PLS-DA显示明显的时间轨迹。正ESI数据中VIP得分最高的脂质包括PC(34:1)、PC(32:1)、SM(d40:1)、TG(50:1)等，其中含C16:0的脂质（如PC(32:0)、TG(48:1)）占显著比例。负ESI数据中FFA、PG、PC、LPE和PE贡献显著，包括FA(22:6)、FA(16:0)、FA(20:4)等。药物浓度与脂质变化的关系复杂，PC（如PC(34:1)）在3小时达最大丰度，TG（如TG(50:1)）在1小时先降再升再降。
**4.4 游离脂肪酸（FFA）靶向分析**
负ESI分析显示多种FFA（FA16:0、16:1、18:0、18:1、18:2、20:4、22:5、22:6）受药物影响。FA(16:0)等从0.5小时降至1小时最低，3–8小时回升，24小时再降；而FA(18:2)和FA(22:6)则从0.5小时缓慢升至8小时，24小时下降。FFA变化与血浆药物浓度未见简单相关。
**4.5 肝脏酰基肉碱（CAR）靶向分析**
正ESI模式检测到多种酰基肉碱（如CAR 2:0、4:0、8:0、14:0、16:0、18:0、18:1）。短链CAR 4:0从0.5小时降至8小时最低，24小时回升；中链CAR 8:0先降后升再降；长链CAR 14:0、18:0、18:1呈现相似模式，但CAR 16:0显著降低且仅24小时轻微恢复。这些变化可能影响脂肪酸进入线粒体进行β-氧化和ATP生产，且长链酰基肉碱（C14-C18:1）已知可激活应激、细胞炎症和死亡通路，可能与吉非替尼的MOA相关。
**5. 总结讨论与结论**
讨论部分指出，非靶向与靶向方法互补，但基于脂质亲脂性和极性差异，两者VIP列表重叠有限（正ESI中8/25相同）。两种方法均观察到时间相关轨迹，但肝脏脂质响应比血浆更为复杂。PC降低与LPC升高符合Lands循环，类似其他药物（如乙硫异烟胺）的作用。脂质变化可能源于吉非替尼本身及其代谢物M6。TG、FFA和酰基肉碱的变化提示药物可能调节脂肪动用和氧化。含C16:0脂质的显著影响与EGFR通过FASN（脂肪酸合酶）介导TKI耐药性的已知机制一致。尽管样本量有限，这些初步结果仍需通过体外通量实验确认，并可能为监测TKI疗效提供非侵入性血浆脂质标志物。
结论翻译：非靶向与靶向脂质表型分析方法的结合为评估吉非替尼对小鼠肝脏脂质组的变化提供了更全面的评估。非靶向RP-UHPLC-IM-MS脂质分析揭示了PC和PE的降低以及LPC的升高，这可能是吉非替尼静脉给药的结果。靶向HILIC-MS分析显示PC、SM、TG、LPC、FFA、PG、LPE、PE和酰基肉碱谱出现明显的时间相关效应。尽管研究存在动物数量少的局限性，这些测量似乎揭示了EGFR抑制剂吉非替尼对肝脏脂质谱的复杂时间依赖性药脂组动力学效应。若通过进一步研究得到确认，这些结果将为TKI抑制效应提供更全面的视角，并揭示这些重要药物的作用模式。
