线粒体途径介导的肠细胞凋亡：柠檬萤叶甲成虫对尼丁吡胺产生毒性的关键机制

《Journal of Asia-Pacific Entomology》：Mitochondrial pathway-mediated gut cell apoptosis: A key mechanism of nitenpyram toxicity in Diaphorina citri adults

　　

李玉宁|胡慧音|姚焕谦|谢新毅|何淑音|刘翠婷|维兰·塞图拉曼|徐汉红|吴忠珍|舒本水

中国广东省广州市510642，华南农业大学植保学院，教育部绿色农药国家重点实验室/天然农药与化学生物学重点实验室

摘要

亚洲柑橘木虱（ACP），即库瓦亚马氏柑橘木虱：Diaphorina citri，是危害全球柑橘产业的重要害虫，它能传播导致黄龙病的病原体——柑橘黄化病毒属候选菌。Nitenpyram是一种第二代烟碱类杀虫剂，对多种半翅目害虫如褐飞虱和烟粉虱具有显著杀灭效果，也被用于防治亚洲柑橘木虱。不过其毒性机制至今尚不清楚。本研究分析了< />对亚洲柑橘木虱成虫的毒性。研究人员对暴露于< />的LC₂₀浓度（12.86?μg/mL）和LC₅₀浓度（38.39?μg/mL）的成虫进行了RNA-Seq分析，分别在两组样本中发现了152个和675个差异表达基因。KEGG富集分析显示，多个差异表达基因与细胞凋亡途径相关。TdT介导的dUTP末端标记（TUNEL）染色进一步证实，LC₂₀和LC₅₀浓度的< />会引发成虫肠道内的细胞凋亡。此外，活性氧水平升高以及线粒体膜电位下降表明，< />可能通过激活成虫肠道中的线粒体凋亡途径发挥作用。这些结果说明，< />通过激活线粒体途径引发亚洲柑橘木虱成虫肠道细胞凋亡，从而产生毒性，为了解该杀虫剂在亚洲柑橘木虱体内的分子毒理机制提供了重要依据。

引言

柑橘黄龙病是全球柑橘产业面临的最严重威胁，也是未来十年植物病理学领域亟需解决的关键问题（Bové, 2014; Wang et al., 2024; Pérez-Hedo et al., 2025）。该病由属于柑橘黄化病毒属候选菌的韧皮部限制型细菌引起，现已在多个大洲的约50个国家蔓延（Bové, 2006; Younas et al., 2025）。受感染的柑橘树会出现叶片斑驳、树冠萎蔫、果实畸形且味道苦涩甚至提前掉落，最终导致树木死亡，造成巨大经济损失（Liu et al., 2025; Pérez-Hedo et al., 2025）。亚洲柑橘木虱（ACP），即库瓦亚马氏柑橘木虱：Diaphorina citri，属于半翅目木虱科，是柑橘黄龙病病原体的主要自然传播媒介，具有持续传播的特性（Liu et al., 2025）。由于该病原体属于韧皮部限制型细菌且具有专性寄生特性，因此难以明确其致病机制，也制约了防治措施的发展（Younas et al., 2025）。因此，目前控制亚洲柑橘木虱的数量被视为遏制柑橘黄龙病蔓延的关键策略。在田间，化学防治是控制亚洲柑橘木虱的主要方法，其中神经毒性杀虫剂被广泛使用，包括拟除虫菊酯、有机磷类和烟碱类杀虫剂（Liu et al., 2023）。但由于杀虫剂抗性的出现和发展，吡虫啉、氯吡硫磷、噻虫嗪和氰戊菊酯等常用杀虫剂的效力逐渐降低（Chen et al., 2026）。因此，迫切需要研究高效替代杀虫剂及其毒理机制。

Nitenpyram（(E)-N-((6-氯-3-吡啶基)甲基)-N-乙基-N′-甲基-2-硝基-1,1-乙二胺）是由武田化学工业株式会社于1989年研发的第二代烟碱类杀虫剂（Ullah et al., 2024）。该杀虫剂通过持续刺激昆虫的烟碱乙酰胆碱受体，作用于昆虫的中枢神经系统，进而阻断中枢神经系统通道，干扰信号传递，最终导致昆虫出现痉挛、瘫痪并死亡（Zhang et al., 2024; Guo et al., 2025）。由于其高效率、广谱杀虫效果以及对哺乳动物的低毒性，Nitenpyram被广泛应用于防治棉蚜、褐飞虱、叶蝉和烟粉虱等刺吸式口器害虫（Ullah et al., 2024; Lu et al., 2024; Wei et al., 2025; Guo et al., 2025）。此外，Nitenpyram对亚洲柑橘木虱也具有显著的杀虫效果。巴基斯坦旁遮普省的柑橘园中已出现了对该杀虫剂产生抗性的种群，相关研究也已开展（Naeem et al., 2016; Naeem et al., 2019）。在中国，10%的< />水乳剂在控制亚洲柑橘木虱方面也表现出良好效果（Xie et al., 2024）。不过，关于< />对亚洲柑橘木虱的毒理机制的研究报道仍较为有限。

RNA-Seq是一种被广泛运用且成效显著的工具，可用于研究杀虫剂针对害虫的分子机制（Xu et al., 2022; Liu et al., 2024）。此前也有研究通过RNA-Seq分析了validamycin对亚洲柑橘木虱的作用机制，结果发现validamycin处理会强烈抑制与几丁质和角质层形成相关的基因表达，从而导致亚洲柑橘木虱体内的几丁质和角质层含量下降（Yu et al., 2021）。通过RNA-Seq分析，研究人员发现了亚洲柑橘木虱成虫中的内向整流钾通道基因是flonicamid作用的差异表达基因，这些基因被认为是该杀虫剂的潜在作用靶点（Zhu et al., 2024）。我们之前的研究也通过RNA-Seq发现，暴露于二氯苯醚菊酯的LC₂₀和LC₅₀浓度下的亚洲柑橘木虱中，细胞凋亡途径存在大量差异表达基因，后来也证实细胞凋亡是二氯苯醚菊酯对亚洲柑橘木虱的亚致死效应之一（Liu et al., 2024）。鉴于RNA-Seq在揭示非目标分子反应方面的优势，它非常适合用于研究< />的毒理机制。

本研究分析了< />对亚洲柑橘木虱成虫的毒性，同时通过RNA-Seq技术探究了LC₂₀和LC₅₀浓度下的< />对亚洲柑橘木虱成虫的分子毒理机制。在亚洲柑橘木虱成虫暴露于LC₂₀和LC₅₀浓度的< />后，研究人员对其肠道进行了TdT介导的dUTP末端标记分析，同时还检测了活性氧水平和线粒体膜电位。这些研究结果为了解< />对昆虫的亚致死效应提供了重要线索。

章节节选

昆虫饲养

本研究中的亚洲柑橘木虱实验种群，是由在中国广东省广州市某公园的野葛上采集的成虫培育而成的。这些若虫和成虫均在未接触杀虫剂的环境下以野葛为食，饲养时间超过三年，饲养环境为温度26?±?1?°C、相对湿度70%，光照周期为12:12小时（明暗比）。

Nitenpyram生物测定

Nitenpyram（分析标准品）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。生物测定实验的具体操作如下：

Nitenpyram对亚洲柑橘木虱成虫具有高毒性

本研究测定了< />对亚洲柑橘木虱成虫的毒性。如表1所示，24小时和48小时时，Nitenpyram对亚洲柑橘木虫成虫的LC₅₀值分别为54.00和38.39?μg/mL，对应的95%置信区间分别为45.08–67.45?μg/mL和31.84–47.42?μg/mL。这些数据表明，Nitenpyram对亚洲柑橘木虱成虫具有高毒性。

转录组的测序、组装与功能注释

为探究亚洲柑橘木虱成虫在接触< />后的初始反应机制，研究人员进行了RNA测序。共获得了9个cDNA序列

讨论

作为危害柑橘产业的重要害虫，亚洲柑橘木虱因能传播导致柑橘黄龙病的病原体而备受关注（Hall et al., 2013）。Nitenpyram是一种具有优异内吸性和渗透性的烟碱类杀虫剂，被广泛用于防治刺吸式口器害虫（Du et al., 2024; He et al., 2024）。本研究评估了< />对亚洲柑橘木虱的毒性，测得其LC₅₀值为54.00

CRediT作者贡献说明

李玉宁：资源获取、实验研究、数据整理。胡慧音：方法设计、实验研究、统计分析、数据整理。姚焕谦：结果验证、资源获取、方法设计。谢新毅：结果验证、数据整理。何淑音：软件应用、资源获取。刘翠婷：资源获取。维兰·塞图拉曼：论文撰写——审阅与编辑。徐汉红：论文撰写——审阅与编辑。吴忠珍：论文撰写——审阅与编辑、项目监督、项目管理。舒本水：论文撰写——审阅与编辑、初稿撰写

资助情况

本研究得到了以下项目的资助：广东省重点建设学科科研能力提升计划（编号：2021ZDJS001）、广东省“十四五”农业科技创新十大重点任务开放竞争项目（编号：2022SDZG06、2023SDZG06、2024KJ29）以及广东省高校创新团队项目（编号：2025KCXTD022）。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

作者衷心感谢堪萨斯州立大学的陈明顺教授对本文手稿的修改指导。