过度训练不会导致骨骼肌线粒体功能障碍或损害胰岛素信号传导

《Journal of Physiology》：Excessive training does not induce mitochondrial dysfunction or impair insulin signalling within skeletal muscle

　　

过度训练（也称为超负荷训练）被认为会损害骨骼肌线粒体功能和葡萄糖稳态，挑战了运动本身有益的观点。然而，在考虑运动诱导的线粒体生物发生的同时，评估线粒体生物能学的方法学局限性使得过度训练的代谢后果仍存在争议。因此，研究人员研究了健康高训练耐力运动员在3周过度训练方案后骨骼肌的胰岛素信号传导和线粒体生物能学。骨骼肌蛋白质组学显示，超负荷训练诱导了与脂肪酸代谢和线粒体含量相关蛋白质的上调。在功能上，通透性肌纤维中的线粒体呼吸能力以及H₂O₂（过氧化氢）释放均增加。这些效应依赖于线粒体含量，表明固有的线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）得以保留。虽然次最大线粒体H₂O₂释放和氧化应激在过度训练后增加，但口服葡萄糖耐量试验（OGTT）中骨骼肌内的胰岛素信号传导（即Akt（蛋白激酶B）磷酸化）得到改善，表明过度运动不会诱导骨骼肌胰岛素抵抗。在进一步分析中，根据参与者的心理生理表现，研究人员确定哪些参与者成功或未发展出过度训练表型。这种方法在过度训练个体中发现了一种独特的蛋白质组特征，其特征是参与细胞骨架组织、糖原代谢和蛋白质翻译的蛋白质增加幅度较小。然而，尽管有如此分类，研究人员未观察到骨骼肌线粒体生物能学或胰岛素信号传导的降低。总之，在高度活跃个体中，过度训练诱导线粒体生物发生，而不会损害骨骼肌胰岛素信号传导或线粒体氧化能力。

**论文解读：过度训练对骨骼肌线粒体功能与胰岛素信号的影响**

### 研究背景与问题
传统观点认为运动训练有益健康，尤其是通过刺激线粒体生物发生、增强呼吸能力、改善葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。然而，近期研究提出，过度训练（overtraining）可能产生负面效应，如损害心肌功能、诱发心律失常、加速冠状动脉钙化、促进肝纤维化，并可能损害骨骼肌线粒体功能及全身葡萄糖稳态。这种矛盾挑战了“运动总是有益”的常识。尽管一些研究报道过度训练会降低线粒体活性氧（mtROS）产生并损害葡萄糖耐量，但其他研究提示这些效应可能源于非骨骼肌因素（如肝脏代谢紊乱）。以往对线粒体生物能学的评估存在方法学局限，例如未考虑运动诱导的线粒体生物发生对呼吸参数归一化造成的影响，使得过度训练是否真正引起骨骼肌线粒体功能障碍或胰岛素抵抗仍存争议。因此，本研究旨在高训练耐力运动员中，通过增加其已较高的训练负荷，系统探究过度训练对骨骼肌线粒体功能、蛋白质组和胰岛素信号传导的影响。

### 研究内容与结论
研究人员对9名健康高训练耐力运动员实施为期4周方案（1周基线减量 + 3周强化训练，总训练量约为基线的150%）。通过在训练前后获取骨骼肌活检（股外侧肌），采用无标记定量蛋白质组学、高分辨率呼吸测定法、H₂O₂荧光测定及Western blot等技术，评估线粒体生物能学、氧化还原状态及胰岛素信号通路。主要结论：
1. 过度训练上调了参与脂肪酸代谢与线粒体含量相关蛋白（如ACADM、CPT1B、CPT2等），并诱导线粒体生物发生（线粒体富集因子MEF升高）。
2. 线粒体呼吸能力（最大复合体I/II耦合呼吸）及呼吸控制比在未归一化时增加，但归一化至MEF后无差异，表明增强的呼吸由线粒体含量增加驱动，而非固有的线粒体功能障碍。
3. 线粒体H₂O₂释放增加，伴随硝基酪氨酸（nitrotyrosine）水平升高（氧化应激标志），但抗氧化蛋白（SOD1、CAT、GPX1/4、PRDX6）也上调；归一化至MEF后，琥珀酸驱动的H₂O₂释放无差异，ADP存在下仍升高，提示线粒体氧化还原调节存在内在改变。
4. 胰岛素信号传导增强：OGTT中血清胰岛素无显著变化，但骨骼肌Akt磷酸化（Thr308位点）在葡萄糖刺激后显著高于训练前；胰岛素信号通路相关蛋白（GLUT4、GYS、HK1等）整体上调。
5. 根据心理生理标准（运动表现下降、情绪评分升高、低频电刺激力降低），6名运动员被归为过度训练（overreached），3名为急性疲劳（acutely fatigued）。过度训练组表现出独特的蛋白质组特征：翻译起始、糖原分解、糖酵解和细胞骨架重塑相关蛋白（如IF5、PYGB、PFKL、PGAM1等）的上调幅度减弱，并与运动表现下降呈正相关。但两组间线粒体功能及胰岛素信号传导无差异。

该研究发表于《Journal of Physiology》。

### 关键技术方法
1. **无标记定量蛋白质组学**：对股外侧肌活检组织进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，结合MitoCarta3.0数据库鉴定线粒体蛋白，并计算线粒体富集因子（MEF）。
2. **高分辨率呼吸测定法**：使用Oroboros O2k呼吸仪评估皂苷通透性肌纤维在复合体I/II底物及ADP梯度下的耗氧速率。
3. **线粒体H₂O₂释放测定**：在通透性肌纤维中，以Amplex Red荧光探针检测琥珀酸驱动的H₂O₂产生及ADP的抑制作用。
4. **Western blot**：检测Akt磷酸化（Ser473、Thr308）、4HNE及硝基酪氨酸蛋白水平。

### 研究结果
#### 过度训练上调能量代谢相关蛋白表达
9名运动员完成方案后，5 km计时赛成绩下降，摄氧量(V?O₂)和峰值乳酸降低，情绪评分升高（表明疲劳、易怒和压力增加），但体重及BMI不变。蛋白质组学鉴定出1442种蛋白，其中805种差异表达（校正P<0.1），经KEGG富集分析显示碳代谢、脂质合成与降解、PPAR信号通路上调，具体包括ACADM、CPT1B、CD36等脂代谢蛋白增加。

#### 过度训练增强线粒体功能（尽管氧化应激增加）
- **呼吸能力**：通透性肌纤维中，最大复合体I/II耦合呼吸在未归一化时显著升高（+ADP P=0.031；+谷氨酸 P=0.046），呼吸控制比提高（P=0.045）。
- **ADP敏感性**：表观ADP K_m有增加趋势（P=0.098），但高浓度ADP下呼吸增强。
- **线粒体含量**：MEF升高（P=0.018），线粒体蛋白（如氧化磷酸化、脂代谢、糖代谢相关）普遍上调（113/152种蛋白上调）。
- **归一化后**：呼吸能力归一化至MEF后无差异（P>0.05），表明增强的呼吸源于线粒体生物发生，而非固有功能改变。
- **H₂O₂释放**：琥珀酸驱动的H₂O₂释放增加（+ADP P=0.027；无ADP P=0.039），ADP抑制H₂O₂的能力减弱（P=0.019）。
- **氧化应激标志**：硝基酪氨酸蛋白水平升高（P=0.026），4HNE无变化；抗氧化蛋白（SOD1、CAT、GPX1/4、PRDX6）上调。
- **相关性**：H₂O₂释放与MEF正相关（r=0.75-0.71）。归一化至MEF后，琥珀酸组H₂O₂释放无差异，ADP组仍有差异（P=0.040）。

#### 过度训练增强骨骼肌胰岛素信号传导
- OGTT中血糖曲线下面积及血清胰岛素无显著变化（P>0.05）。
- 总Akt含量不变，但葡萄糖刺激后Akt Thr308磷酸化水平在训练后显著高于训练前（Training status×Glucose交互作用P=0.020；训练后葡萄糖刺激vs训练前P=0.006）。Akt Ser473磷酸化仅显示葡萄糖主效应（P<0.0001）。
- 蛋白质组中胰岛素信号通路（KEGG hsa04910）相关蛋白普遍上调，包括GLUT4（SLC2A4）、GYS1/2、HK1、MP2K1/2等。

#### 过度训练可能引发骨骼肌独特的分子指纹
- 6名过度训练组与3名急性疲劳组在PCA中分离。
- 两组均显示蛋白整体上调，但过度训练组上调幅度较小，87种蛋白在组间差异表达（下调）。
- 富集分析显示下调蛋白涉及翻译预起始复合物形成（GO:0001731）、糖原分解（GO:0005980）、糖酵解（GO:0006096）及细胞骨架组织负调控（GO:0051494）。
- 变化蛋白质（如IF5、PYGB、LYAG、CYRIB、PFKAL等）与计时赛功率变化呈正相关（r=0.46-0.71），与低频电刺激力变化相关性较弱（r<0.4）。
- 两组间线粒体呼吸能力、H₂O₂释放、血糖AUC及Akt磷酸化变化均无显著差异。

### 总结与讨论
本研究结果表明，在高训练耐力运动员中，过度训练不会损害骨骼肌线粒体生物能学或胰岛素信号传导，反而诱导线粒体生物发生并增强胰岛素敏感性。尽管存在氧化应激（硝基酪氨酸升高）和H₂O₂释放增加，但抗氧化防御系统也上调，且线粒体固有呼吸能力保持完好。研究还发现，过度训练个体与急性疲劳个体在骨骼肌蛋白质组上存在差异，主要表现在翻译、糖原代谢和细胞骨架重塑相关蛋白的上调减弱，这可能解释运动表现下降，但线粒体功能和胰岛素信号传导仍保留。这些发现挑战了“过度训练必然导致骨骼肌代谢功能障碍”的观点。

**研究结论**：总述，研究人员得出结论，超负荷训练诱导线粒体生物发生，而不会损害高度训练运动员骨骼肌的线粒体生物能学或胰岛素信号传导。此外，在过度训练个体与未过度训练个体之间发现了独特的蛋白质组特征，提示运动训练适应的基本分子基础。