穗花杉双黄酮通过靶向Smoothened (SMO)蛋白抑制视网膜母细胞瘤细胞干性

《Stem Cells International》：Amentoflavone Suppresses Stemness of Retinoblastoma Cell via Targeting Smoothened (SMO) Protein

　　

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)是一种恶性眼内肿瘤，对公共卫生构成重大挑战，尤其是对儿童群体，突显了对创新治疗方法和新型药物开发的迫切需求。在本研究中，穗花杉双黄酮(amentoflavone, AMF)被鉴定为一种潜在的抗RB癌症干细胞(cancer stem cells, CSCs)的药剂。虽然CCK8实验显示AMF对RB细胞系具有中等的抗增殖作用，但迁移和侵袭实验表明其具有抑制癌细胞运动的强大能力。肿瘤球形成实验进一步表明AMF显著降低RB细胞干性。qRT-PCR分析显示AMF以剂量依赖性方式下调干细胞标志物(CD44、CD133、Oct4和Nanog)的表达。体内研究证实AMF抑制肿瘤转移并延长RB小鼠模型的生存期。为阐明其作用机制，研究人员采用了RNA测序、分子对接和表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)。这些分析揭示AMF直接靶向Smoothened (SMO)以破坏音猬因子(Sonic Hedgehog, SHh)信号通路，从而抑制RB干细胞(retinoblastoma stem cells, RBSCs)的自我更新和肿瘤进展。这项工作揭示了AMF阻碍RB发展的一个先前未报道的机制，并突出了其作为这种侵袭性儿科癌症有前景的治疗候选药物的潜力。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)是五岁以下儿童最常见的恶性眼内肿瘤，通常在晚期才被诊断，对生命构成重大风险。当前RB的主要管理方案包括化疗和免疫疗法，通过靶向RB细胞产生细胞毒性效应并诱导凋亡。然而，化疗相关的副作用限制了治疗疗效。因此，确定新型治疗策略对于改善RB患者的预后至关重要。穗花杉双黄酮(amentoflavone, AMF)是一种从多种中草药中分离的双黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗焦亡等多种治疗活性。大量研究已强调其显著的抗癌作用，能抑制多种常见人类癌症（如乳腺癌、肺癌、结直肠癌和食管癌）的进展，但其对RB的影响尚待阐明。Hedgehog (Hh)信号通路是一个高度保守的细胞信号系统，在胚胎发育、组织再生、细胞增殖和分化中发挥关键作用。该通路的异常激活或抑制与多种疾病的发生发展密切相关。在癌症中，Hh信号通路的异常激活包括配体依赖性激活和非配体依赖性激活。在基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC)中，约85%的散发性BCC病例存在Ptch1基因失活突变，导致Hh通路异常激活。髓母细胞瘤(medulloblastoma, MB)的发生发展也显著受Hh通路异常激活影响。然而，Hh信号通路在RB中的作用机制目前尚不清楚。大量研究表明RB的原发肿瘤和细胞系中均存在癌症干细胞(cancer stem cells, CSCs)。本研究表明AMF在体外显著降低RB细胞的迁移和浸润，同时在体内抑制这些肿瘤细胞的转移，从而提高小鼠存活率。观察发现AMF有效阻断RB中的SHh信号通路，提示这是一种治疗RB的新方法。

**研究内容与结论**
研究人员通过体外和体内实验系统评估了AMF对RB细胞的作用。结果显示：AMF在体外通过阻断细胞周期于G0/G1期发挥中度的抗增殖作用，但几乎不诱导凋亡；AMF显著抑制RB细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，下调波形蛋白(vimentin)水平并上调E-钙黏蛋白(E-cadherin)水平，同时降低基质金属蛋白酶-2和-9 (MMP2/9)的表达；AMF剂量依赖性地破坏肿瘤球形成，降低肿瘤球发生率，并通过有限稀释实验(limiting dilution assay, LDA)证实其降低干细胞频率；qRT-PCR显示AMF下调干细胞标志物OCT4、Nanog、CD44和CD133的mRNA水平。体内药代动力学研究显示AMF具有良好的口服生物利用度(F% = 68%)和血浆暴露浓度。在尾静脉肺转移模型中，AMF口服给药(100 mg/kg)显著延长小鼠存活期，并减少肺部转移灶。机制上，转录组学分析（GSEA）提示AMF抑制Hh信号通路；药物亲和力响应靶标稳定性(drug affinity responsive target stability, DARTS)实验结合质谱鉴定发现AMF直接靶向SMO蛋白；表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)证实AMF与SMO具有强结合亲和力(Kd = 2.73 μM)；分子对接模拟显示AMF与SMO的TRP-109、GLY-162和LEU-489形成氢键，并与TRP-109形成π-π堆积作用。Western blot证实AMF下调SHh通路组分（SHh、Ptch、SMO）及下游转录因子Gli的表达。进一步通过Hh激动剂SAG实验表明AMF可拮抗SAG诱导的肿瘤球形成和CD133+/CD44+细胞群增加。构建SMO敲低的稳定细胞系(shSMO)后，AMF的抗增殖和抗干性效应显著减弱，表明AMF主要通过靶向抑制SMO发挥其药效。

**关键技术方法**
研究人员使用的主要关键技术方法包括：CCK8法检测细胞增殖和IC50值；流式细胞术检测细胞周期和凋亡；Transwell迁移和侵袭实验评估细胞运动能力；Western blot检测EMT及Hh通路蛋白表达；肿瘤球形成实验和有限稀释实验评估干细胞特性；qRT-PCR检测干细胞标志物mRNA水平；药代动力学研究评估口服生物利用度；尾静脉肺转移模型（使用严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠）评估体内转移抑制；RNA测序结合基因集富集分析(GSEA)进行转录组学分析；药物亲和力响应靶标稳定性(DARTS)实验结合LC-MS/MS鉴定直接靶点；表面等离子体共振(SPR)测定结合亲和力；AutoDock Vina进行分子对接模拟；慢病毒介导的shRNA技术构建SMO敲低的稳定细胞系。细胞系来源：人RB细胞系Y79和WERI-RB27、人视网膜色素上皮细胞ARPE-19、人肝癌细胞LO2、人肠上皮细胞Caco2均购自ATCC。

**研究结果**
3.1 AMF在体外抑制RB细胞增殖：CCK8实验显示AMF对Y79和WERI-RB27细胞具有中度抗增殖作用，IC50分别为42.36 μM和52.54 μM；对正常细胞（ARPE-19、LO2、Caco2）在100 μM浓度下无显著影响。细胞周期分析显示AMF引起G0/G1期阻滞，但凋亡检测显示几乎不诱导凋亡（凋亡率<5%）。
3.2 AMF抑制RB细胞迁移、侵袭和EMT：迁移和Transwell侵袭实验显示AMF降低Y79和WERI-RB27细胞的迁移和侵袭能力。Western blot显示EMT标志物变化：波形蛋白(vimentin)下降，E-钙黏蛋白(E-cadherin)升高，同时MMP2和MMP9表达下调。
3.3 AMF减弱RB细胞干性：肿瘤球形成实验显示AMF破坏并减少肿瘤球数量；有限稀释实验证实AMF降低肿瘤球形成频率。qRT-PCR显示AMF剂量依赖性地降低干细胞标志物OCT4、Nanog、CD44和CD133的mRNA水平。
3.4 AMF体内药代动力学研究：AMF口服生物利用度为68%，血浆暴露浓度满足动物实验要求。
3.5 AMF抑制RB细胞体内转移：尾静脉肺转移模型显示，AMF口服给药(100 mg/kg)显著延长小鼠生存期，并减少肺部转移灶（H&E染色证实），且小鼠体重无明显变化，耐受性良好。
3.6 AMF通过直接靶向SMO蛋白损害SHh信号通路：RNA-seq结合GSEA分析提示AMF抑制Hh信号通路；热图显示AMF下调GLI1、GLI2、GLI3、PTCH、Shh和SMO等关键基因表达。DARTS实验结合LC-MS/MS鉴定SMO为AMF的直接靶点。SPR证实AMF与SMO的强结合(Kd = 2.73 μM)。分子 docking模拟显示AMF与SMO的TRP-109、GLY-162和LEU-489形成氢键及π-π堆积。Western blot证实AMF下调SHh、Ptch、SMO和Gli蛋白表达。使用Hh激动剂SAG的挽救实验表明AMF可逆转SAG诱导的肿瘤球形成增加和CD133+/CD44+细胞比例升高。SMO敲低实验显示，敲低SMO后AMF的抗增殖和抗干性效应显著减弱，进一步证明AMF通过靶向SMO发挥作用。

**讨论与结论**
讨论部分指出，AMF作为一种广泛存在于多种植物和天然食物提取物中的天然黄酮类化合物，具有多种生理活性。先前研究显示AMF能抑制多种肿瘤增殖，但关于其在RB治疗中的应用报道很少。本研究通过多个细胞和动物模型验证了AMF在体内外抑制RB细胞增殖、迁移和侵袭，并显著延长荷瘤动物存活期。值得注意的是，AMF具有良好的口服生物利用度和安全性，使其成为抗RB药物开发的先导化合物。研究聚焦于AMF靶向抑制RB癌症干细胞(RBCSCs)的活性。此前仅有一项研究(Bao等人)报道AMF通过抑制Hh信号通路抑制三阴性乳腺癌干细胞活性，但未深入探讨AMF的直接靶点。本研究中，研究人员通过DARTS实验鉴定AMF与SMO结合，且结合亲和力强(Kd = 2.73 μM)；分子 docking模拟了结合模式；SMO敲低实验表明SMO缺失后AMF的抑制作用显著减轻，充分证明AMF通过靶向抑制SMO蛋白来抑制RB进展。SMO作为SHh信号通路中的关键跨膜蛋白，是已确认的药物靶点，FDA已批准多种SMO抑制剂（如Vismodegib、Sonidegib、Glasdegib）用于多种恶性肿瘤。本研究不仅揭示了AMF强大的抗RBCSC活性和新机制，还为开发创新的SMO靶向药物提供了新的先导结构。

研究结论部分翻译如下：总之，在本工作中，研究人员证明AMF能够显著减弱RB细胞的增殖、迁移和侵袭，并提高异种移植模型中小鼠的存活率。通过RNA测序分析，揭示AMF通过抑制SHh信号通路靶向RB干细胞。本研究揭示了一种AMF阻碍RB进展的新分子机制，并为治疗该疾病提供了一种有前景的治疗策略。