《Materials Today Advances》：Plant-derived exosome-like nanovesicles: From biological characteristics to precision medicine applications as multifunctional delivery platforms
外泌体是高效的药物载体，具有生物相容性、低免疫原性和强靶向能力。植物源外泌体样纳米囊泡（PELNs）的近期发现为该领域带来了突破性进展。与动物源外泌体相比，PELNs来源广泛、成本低廉、安全性高且稳定性更好，是理想的替代选择。本综述通过比较分析，强调PELNs作为下一代药物载体的优势。研究人员系统综述了PELNs的生物学特征，包括不同来源的分离方法和功能多样性。此外，研究人员阐述了药物装载策略，基于载体角色对PELNs进行分类，并讨论了基于纳米平台的递送系统。基于现有研究，研究人员总结了PELNs在多种疾病治疗方面的应用进展，并展望了其发展趋势和面临的挑战。
**1. 引言**
药物递送系统（Drug Delivery Systems, DDSs）是连接药物分子与临床疗效的关键技术，也是现代转化医学和药物研究的核心领域之一。经过数十年发展，药物递送技术已从传统制剂逐步演进为靶向递送、智能响应递送和纳米递送等新一代系统。然而，其广泛的临床应用和安全转化仍面临诸多挑战。
纳米技术催生了纳米级药物载体的发展，包括脂质体（Liposomes）、聚合物纳米颗粒（Polymeric Nanoparticles）和金属纳米材料等，与传统剂型相比具有改善的药代动力学特性。然而，这些合成纳米载体的临床转化受到根本限制。脂质体作为临床上最先进的纳米平台，由于网状内皮系统（Reticuloendothelial System, RES）的快速清除和肿瘤渗透的异质性，其肿瘤递送效率低下（中位数仅为注射剂量的0.7%）。聚乙二醇（PEG）化虽旨在延长循环时间，却 paradoxically 诱导加速血液清除现象（ABC现象）和重复给药后的免疫记忆。此外，脂质体在胃肠道环境中稳定性差，易受胆盐破坏和酶降解，无法口服给药。聚合物纳米颗粒和金属纳米材料（Au、Ag）则存在潜在的细胞毒性、剂量依赖性器官蓄积和炎症反应等问题，影响其长期安全性。合成载体的表面工程用于主动靶向常受限于配体变性、结合效率不一致和制造规模化复杂等。
哺乳动物细胞来源的外泌体作为具有固有多肽本征生物相容性和靶向能力的天然替代品出现，在细胞间和种间通讯中发挥关键作用。然而，其临床转化受到分离产量低、生产成本高、培养条件复杂以及可能抑制宿主防御机制的免疫调节因子共纯化等问题的严重制约。批次间差异和病原体传播风险进一步限制了规模化生产。
PELNs代表一类独特的天然纳米载体，系统性地解决了合成纳米载体和动物源外泌体的局限性。这些纳米级囊泡（30–150 nm）大量存在于可食用植物部位，包括水果、蔬菜、根、块茎、坚果和种子。作为天然植物成分，PELNs具有多项独特优势：其一，表现出卓越的生物相容性和安全性，无动物源性病原体、低免疫原性且毒性为"食品级"；其二，具有由植物特异性脂质（如磷脂酸和双半乳糖甘油二酯）和表面分子介导的天然靶向能力，促进选择性细胞摄取和跨器官迁移；其三，具有胃肠韧性，对胃酸、胆盐和消化酶具有固有稳定性，从而实现口服生物利用度；其四，通过农业 sourcing 实现可扩展和经济的生产，无需昂贵的生物反应器和细胞培养基；其五，通过预装载生物活性 cargo（包括miRNAs和次生代谢物）发挥双重治疗-载体功能。
**2. PELNs的生物学特性及其来源依赖性功能**
**2.1. PELNs的生物发生与结构特征**
PELNs是由植物细胞释放的膜结合纳米囊泡，构成细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的重要类别。通常直径为30–150 nm，作为植物细胞间通讯和物质运输的关键介质，能够递送脂质、蛋白质、次生代谢物和核酸等多种生物活性成分。PELNs的生物发生与动物外泌体类似，主要起源于内体系统。具体而言，内体膜的向内出芽形成腔内囊泡（Intraluminal Vesicles, ILVs），后者进一步组装成多泡体（Multivesicular Bodies, MVBs）。当MVBs与质膜融合时，ILVs被释放到细胞外基质并最终成熟为外泌体。该过程确保PELNs携带特定 cargo 并执行生物学功能。PELNs可从种子、果汁、果肉、根茎和脱水植物材料等多种植物组织中分离。EVs的表征依赖于多种理化特性，如密度、粒径、细胞来源和生化组成。
研究人员从葡萄汁中成功分离出可食用PELNs，电子显微镜显示这些纳米颗粒呈球形。透射电子显微镜表明这些形态可导致球形或杯状囊泡，具有典型的双层膜结构。在分泌和功能范围方面，PELNs由大多数植物细胞合成和分泌，不仅能在相邻植物细胞间介导信号传递，还能跨所有三个生命域的有机体进行通讯。作为关键递送载体，它们通过细胞间通讯途径对多细胞生物的生理活动发挥调控作用。结构上，这些纳米级囊泡由脂质双层膜包裹，可分泌到细胞外基质。值得注意的是，PELNs富含RNA、蛋白质和脂质等多样化生物活性物质。与哺乳动物外泌体类似，PELNs可按其生物发生机制分为不同亚群，导致蛋白质标志物、粒径和生物学功能存在显著异质性。
**2.2. 不同植物来源PELNs的多样性及其功能应用**
随着超速离心等标准化分离纯化技术的不断完善，PELNs已从水果、根、种子和叶等多种植物组织中成功分离。不同植物来源的EVs显示出独特的功能特征。姜源PELNs（GELENs）通过膜脂质中高含量的磷脂酸（PA）和双半乳糖甘油二酯（DGDG）选择性靶向结肠巨噬细胞和上皮的细胞，封装的6-姜烯酚和miRNAs（如csi-miR396e-5p）赋予其抗炎和基因调控功能。
姜黄源外泌体（TELNs）是由蛋白质、脂质、核酸和小分子组成的植物源细胞外囊泡，含7.22%的PA，可重排细胞骨架促进靶细胞摄取；7.93%的磷脂酰胆碱（PC）介导跨器官迁移。富含的甲氧基姜黄素和调控次生代谢物的miRNAs等生物活性成分协同赋予其优异的生物相容性和靶向安全性。研究人员通过超速离心法成功分离TELNs，提取率为1.71±0.176 mg/g。多组学分析揭示了其脂质、蛋白质（如姜黄素合成酶）和RNA组分。
马齿苋（POL）是全球广泛应用的草药，具有抗炎、免疫调节、抗氧化和抗肿瘤活性。研究人员从可食用马齿苋中分离并表征了外泌体样颗粒（PERN），其纳米级尺寸约160 nm，负zeta电位?31.4 mV，可能因静电稳定性而增强胃肠耐受性和结肠炎症位点特异性靶向能力。组分分析显示存在核酸、脂质和蛋白质等生物活性物质。脂质成分可能介导鼠李糖乳杆菌增殖，而活性分子通过激活AhR并下调Zbtb7b，将常规CD4
+ T细胞重编程为CD4
+CD8
+双阳性T细胞，从而赋予PERN靶向抗炎和免疫调节功能。
采用不同技术路线，研究人员开发了从卷心菜（Cabex）和红卷心菜（Rabex）中高效分离PELNs的方法。Cabex每克卷心菜产量高达1.504×10
11颗粒，平均每公斤成本仅2.0美元，展现出卓越的经济可行性。表征和生物学功能评估显示，脂质双层结构不仅为封装核酸治疗药物提供保护屏障，还通过高效miRNA装载实现特定细胞的靶向递送。Cabex和Rabex不仅能调节细胞功能、促进增殖，还能显著抑制炎症和凋亡。鉴于其低细胞毒性、多功能性、低生产成本、高产量以及作为癌症治疗miRNA药物递送载体的靶向特异性，研究人员认为它们是治疗药物开发的有前景的新型候选物。
大蒜源PELNs具有显著特性。研究人员分离纯化PELNs后发现，其可缓解炎症性皮疹并阻止循环单核细胞向肝脏迁移。其潜在机制与抑制C-C趋化因子受体（CCR）2型（CCR2）/CCR5信号通路和减少巨噬细胞浸润相关。
在营养健康领域，研究人员从高抗氧化草莓品种中分离出PELNs，富含花青素、叶酸、黄酮醇和维生素C（0.416 nmol/μg）。miR166g的特异性富集和2′-O-甲基化修饰可能赋予跨物种稳定性。脂质双层结构保护维生素C免受胃肠道降解，并通过囊泡内化途径将其高效递送至人间充质干细胞，显著抑制氧化应激且无细胞毒性，开创了口服营养补充和联合治疗的新型靶向营养治疗途径。
木瓜源外泌体的研究也取得进展。研究人员优化PEG沉淀和酶消化条件，分离出粒径约168.8 nm、负膜电位?9.4 mV的稳定囊泡。这些囊泡无细胞毒性，通过下调iNOS/COX-2通路降低亚硝酸盐浓度，同时调节IL-6/IL-1β和IL-10水平，发挥抗炎作用。该抗炎作用可能由生物活性成分5-羟甲基糠醛（5-HMF）介导，其通过抑制NF-κB信号通路发挥作用。
此外，从果汁中分离的柑橘纳米囊泡可通过调节巨噬细胞极化重编程，促进血管和纤维母细胞再生，改善糖尿病伤口愈合。将这些囊泡装载入GelMA-DAS水凝胶，利用水凝胶的组织粘附和缓释特性，进一步增强其在伤口部位的靶向滞留和治疗效果。研究人员从葡萄柚汁中分离纯化PELNs，发现这些EVs抑制人白血病细胞和患者来源的骨髓胚细胞生长。其抗白血病作用主要归因于富含抗氧化成分（如抗坏血酸和过氧化氢酶）诱导白血病细胞的氧化应激。另有研究人员采用整合方法从番茄中提取EVs，证实番茄果实来源的小EVs作为新型植物基DDS用于结肠癌治疗的可行性和有效性。
咖啡源外泌体（CFELNs）作为世界第二大消费饮料的来源，近期成为研究热点。研究评估了CFELNs在阿尔茨海默病（AD）中的潜在治疗效果。体外实验表明，CFELNs处理显著提高了β-淀粉样蛋白（Aβ）损伤小鼠海马神经元细胞（HT-22）的存活率，并改善了线粒体膜电位，表明CFELNs通过修复线粒体功能障碍发挥神经保护作用。
桑树源外泌体（MELNs）已成为研究焦点，在外泌体递送中展现独特优势。本研究创新性地将其应用于修复UVB辐射损伤。紫外线B（UVB）辐射穿透真皮，诱导大量活性氧（ROS）产生，导致皮肤细胞坏死和凋亡。常规防晒霜难以实现损伤后修复，因为其经皮渗透不足。诃子酸（CA）是植物单体和诃子的主要活性成分，在促进UVB损伤修复方面显著优于其他单体。其机制涉及通过激活MAPK信号通路调节IL-6和IFN-β表达。为克服皮肤屏障限制，研究人员利用MELNs开发了CA递送系统（CA@MELNs）。体内外实验证实，该递送系统中可解离的CA显著增强了经皮效率和抗UVB功效。
为应对肝细胞癌（HCC）的治疗耐药性和有限治疗选择等挑战，研究人员从菝葜根茎中分离出天然外泌体样颗粒（SCRENs，直径139.7 nm）。这些SCRENs通过线粒体自噬-铁死亡相互作用机制发挥强效抗肿瘤作用。体外实验显示，SCRENs在HepG2细胞中表现出最高敏感性，显著抑制HCC细胞增殖和迁移，同时诱导凋亡。该效应通过GPX4/ACSL4轴的双重调控实现：同时抑制GPX4以削弱抗氧化防御，并上调ACSL4促进脂质过氧化，同时诱导线粒体膜去极化、线粒体DNA丢失和超微结构损伤，从而激活线粒体自噬。
研究人员从羊栖菜中成功分离出外泌体（SELNs），并系统评估了其对小鼠鼠伤寒沙门氏菌诱导结肠炎的保护作用。结果表明，SELNs利用其延长的肠道滞留和结肠靶向特性，通过减轻体重下降、逆转结肠缩短和减少组织学损伤，显著改善典型结肠炎病理表型。同时，它们上调紧密连接蛋白和MUC2表达以恢复肠道屏障完整性。在机制层面，SELNs通过多途径调节炎症微环境，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号轴，下调TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子，同时升高IL-10和IL-22等抗炎因子。抑制iNOS活性减少氧化应激损伤，通过特异性富集拟杆菌属和促进短链脂肪酸（SCFA）产生重塑肠道菌群组成。
**2.3. PELNs的保存与表征**
保存与表征是确保PELNs在研究和临床应用中稳定性和可靠性的关键阶段。保存目前主要依赖冷冻保存（常用4°C、?20°C和?80°C）和干燥技术（如冷冻干燥），旨在维持囊泡结构完整性和生物活性。然而，低温储存受运输条件限制，反复冻融可能导致冰晶损伤、形态改变和多囊泡形成，从而影响理化性质和生物学特性。为减轻冷冻过程中的结构损伤，常规添加渗透性保护剂（如甘油和乙二醇）和非渗透性保护剂（如蔗糖和海藻糖）。
PELNs的鉴定需要综合评估其理化特性和生物学特征。理化特性主要包括通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）测定平均粒径、粒径分布和表面电荷（zeta电位），以及通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）或原子力显微镜（AFM）观察超微结构，常见形态为球形或圆盘状囊泡。生物学特征方面，蛋白质标志物检测是关键步骤，通常使用蛋白质印迹法（Western Blotting）进行分析。
**3. PELNs的分离与纯化**
分离纯化是探索PELNs结构特征、组分谱和功能特性的关键步骤。差速超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱法（SEC）和基于沉淀的技术等相关技术的最新进展，显著优化了植物源囊泡的分离纯化流程。
**3.1. 超速离心**
超速离心是分离外泌体的常用方法。利用外泌体沉降系数和密度的差异，该技术可产生高达1,000,000×g的离心力，实现细菌、病毒和细胞器等小颗粒的分离。主要分为差速超速离心和密度梯度离心。差速超速离心是分离PELNs的标准方法，涉及300–400×g、2000×g和10,000×g的多级离心，随后以超过100,000×g的力对目标样品进行离心和纯化步骤。该方法因操作简单、成本可控而广泛应用，但存在局限性，包括PELNs易被其他囊泡和蛋白聚集体污染、处理时间长和设备成本高等。
密度梯度离心的关键步骤是在离心管中构建密度从低到高的梯度介质，然后将样品铺在梯度介质上。离心过程中，外泌体和其他颗粒因大小、质量和密度差异形成离散区带，从而实现相应组分的有效分离。例如，2019年提出的"缓冲-密度梯度超速离心"可避免直接沉淀的复杂性，进一步纯化外泌体。使用该技术可获得比标准差速超速离心纯度更高的外泌体组分。然而，该操作耗时且需要精确处理。
研究人员采用超速离心（100,000×g，2 h，4°C）从姜中提取外泌体样纳米囊泡，并系统比较了该方法与蔗糖梯度超速离心、膜过滤和PEG沉淀的效果。结果表明，超速离心来源的GELNs表现出最高的蛋白质完整性、最佳稳定性和最强的抗肺癌活性。非靶向代谢组学分析显示，超速离心更好地保留了10-姜酚和六氢姜黄素等关键生物活性成分。该研究推荐超速离心作为需要高生物活性实验研究的最佳方法。
研究人员采用蔗糖密度梯度超速离心（100,000×g，2.5 h）从人参中提取外泌体，在8–30%和30–45%蔗糖界面收集目标外泌体。所得外泌体平均粒径256 nm，形态完整，产量为168–500 mg蛋白/kg人参。该方法有效去除蛋白聚集体并防止核酸污染，适用于大规模批量生产。
此外，植物和动物外泌体分离方法差异显著。在分离原理方面，两者均利用密度和沉降系数，但植物细胞具有细胞壁，结构更为复杂。细胞壁的刚性结构（由纤维素、半纤维素和果胶组成）阻碍囊泡释放，而机械破坏易导致囊泡与碎片共沉淀。研究人员采用消化酶降解主要细胞壁成分，不仅促进细胞壁内EVs的释放，还促进其从细胞壁释放到周围溶液中。典型外泌体分离可能无法有效打破细胞壁，使PELNs的释放和分离困难。PELNs分离更为复杂，需要过滤等操作去除细胞壁碎片和其他大分子杂质。与一般外泌体分离相反，动物体液样本的预处理相对简单。此外，PELNs分离后需要纯化以消除干扰后续研究的杂质，因为植物样本中存在色素和多糖等特定成分。而在典型外泌体分离的纯化过程中，这些因素无需考虑。
**3.2. 超滤**
超滤是一种依赖于分子量或粒径排阻的分离技术。它使用不同孔径的滤膜实现多种分离目的：截留外泌体、消除小分子污染物（如游离蛋白）、从样本中分离EVs，以及根据粒径差异区分外泌体与共存囊泡。与超速离心相比，超滤不需要长时间离心或配方稀释，且无论纳米颗粒密度如何都能分离游离药物，是经典超速离心的理想替代方法。
该方法快速、高效，适用于大规模提取，充分保持外泌体完整性并降低破裂风险。但可能造成堵塞、囊泡截留和剪切应力损伤，可通过蛋白酶预处理或切向流过滤解决。超滤的另一限制是存在粒径与外泌体相近的纳米颗粒共存。为解决此问题，研究人员整合多种分离技术以实现更精确的分离。操作中，不当的跨膜压力可能影响外泌体的天然状态并导致功能丧失，因此应避免外泌体的变形和破碎。
在姜外泌体多种提取方法的比较研究中，膜过滤（超滤）被评估为替代方法。虽然该方法具有操作简单、成本较低的优势，但存在囊泡结构损伤和纯度中等的问题。研究表明，引入切向流过滤可能是减少商业化生产中结构损伤的可行策略。
超滤用于PELNs分离与典型外泌体应用差异较大。从样本特性角度看，由于细胞壁的存在，植物样本结构更为复杂，超滤前必须打破细胞壁以释放外泌体。若一般外泌体来源于动物体液，样本预处理则相对简单。操作程序方面，PELNs超滤前必须通过过滤去除细胞壁碎片、色素等大分子杂质，这一步骤对降低滤膜堵塞风险至关重要。相反，一般外泌体超滤时样本中杂质含量相对较低，整个过程更高效。杂质管理方面，植物样本中的特定成分（如多糖和色素）可能对超滤效率产生不利影响，因此优化超滤条件或结合超滤与其他纯化技术以减轻这些影响至关重要。一般外泌体分离过程中，这些杂质的影响无需考虑。
**3.3. 尺寸排阻色谱法**
尺寸排阻色谱法（SEC）由Lathe和Ruthven于1955年开发。该技术旨在水溶液中分离不同分子量的溶质，当溶液流过由淀粉和水制成的柱时实现分离。具体而言，当液体样品通过柱内多孔凝胶填料时，基于分子大小产生不同的洗脱顺序。小分子物质可进入凝胶孔内，从而较晚从柱中洗脱。相反，大分子物质无法穿透凝胶孔，导致较早洗脱。
在治疗应用和功能研究中，SEC不改变囊泡大小或特性，去除体液中大部分蛋白质，维持囊泡结构和构象，通过被动重力流操作而不影响囊泡完整性。因此，它是生物标志物发现和治疗应用的理想选择。然而，SEC存在通量低、单次运行时间长等缺点。此外，部分外泌体可能吸附到柱填料上，导致样本损失和回收的EVs数量有限。
研究人员采用差速离心联合尺寸排阻色谱的整合策略，有效分离番茄果实中的微囊泡和纳米囊泡。其发现表明，在差速超速离心后引入SEC纯化显著减少蛋白杂质，提高分离纳米囊泡的纯度，并保持囊泡结构的形态完整性。该优化方案建立了来源于番茄组织的外泌体生物生产标准化操作程序。
研究人员采用差速离心偶联尺寸排阻色谱（SEC）从卷心菜和红卷心菜中分离外泌体样纳米囊泡（Cabex和Rabex）。与超速离心和PEG沉淀相比，SEC来源的外泌体表现出相对均匀的单峰（平均粒径98.8 nm），而前两种方法的多峰图谱表明纳米颗粒异质性。该方法获得的外泌体具有 template 低细胞毒性、高产量和显著的抗炎抗凋亡活性，是新型治疗药物开发的有前景候选物。
PELNs的分离过程与典型外泌体不同。分离外泌体时，必须全面考虑生物系统的复杂性和组分特征。此外，分离方法的选择取决于样本来源和外泌体功能研究重点等多重因素。由于植物独特的细胞壁结构，PELNs在分离前通常需要特定预处理。该预处理的目标是分解细胞壁同时确保外泌体保持完整。此外，植物样本含有大量多糖和色素等特定成分，这些成分干扰外泌体的有效分离。因此，选择PELNs分离方法时，需更加关注去除这些植物特异性杂质，因为该步骤对确保分离的外泌体具有高纯度并保留生物活性至关重要。
**3.4. 聚合物诱导沉淀**
聚合物诱导沉淀是外泌体分离的常用方法，其工作原理与乙醇介导的核酸沉淀类似。在该分离方法中，强亲水性的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用，导致形成疏水微环境从而引发外泌体沉淀。
该方法因无需专用设备、操作简单和外泌体产量高而日益增多使用。此外，分离的EV miRNAs可获得更高的产量、纯度和数量，但不针对起始细胞。研究人员采用改良的PEG 8000沉淀法，经济高效地从大葱中分离外泌体样纳米囊泡（GDENs）。具体流程包括：将大葱均质化，随后差速离心（3000×g、7000×g和12,000×g）去除杂质，上清液经0.45-μm膜过滤，加入8% PEG 8000，4°C沉淀过夜，7000×g离心30 min收集沉淀。所得GDENs平均粒径167.4 nm，zeta电位?16.06 mV，有效抑制HT-22细胞中谷氨酸诱导的铁死亡，同时上调GPX4表达。
研究人员通过聚乙二醇（PEG）过夜沉淀结合逐步过滤和低温离心，从凉薯块根中提取外泌体。所得YB-PDENs粒径236.83±9.27 nm，zeta电位约?26.5 mV，表现出优异的生物相容性和稳定性（4°C稳定一个月）。这些外泌体促进成纤维细胞迁移、增加胶原蛋白合成并抑制黑色素产生，显示其在皮肤修复和美白应用中的潜力。
然而，聚合物诱导沉淀存在一些缺点：外泌体定量常依赖于总蛋白含量测定，聚合物不可避免地与非特异性蛋白和其他非外泌体颗粒共沉淀，容易导致定量误差并可能影响下游分析。研究发现，仅沉淀分离的外泌体对细胞增殖无积极影响，提示可能含有抑制细胞生长的细胞毒性化学物质。
聚合物诱导沉淀在分离PELNs与典型外泌体应用中存在差异。在聚合物沉淀应用中，不同生物系统中复杂成分的干扰是主要问题，如动物体液中的多种蛋白质和微生物代谢物，沉淀过程中必须尽量减少这些杂质的共沉淀。植物样本中含有大量多糖、色素等特定成分，与聚合物相互作用影响沉淀效率和外泌体纯度。植物细胞壁破碎后产生的碎片也可能共沉淀到外泌体中。因此，使用聚合物诱导沉淀分离PELNs时，必须对植物样本进行预处理去除杂质，并调整聚合物的浓度和类型以减少杂质沉淀，获得更高纯度的PELNs。
**3.5. 免疫捕获**
免疫亲和捕获适用于基于抗原-抗体特异性结合原理的PELNs靶向分离，可实现高纯度分离。该方法依赖于外泌体膜上特定蛋白的独特或高富集表达，如溶酶体相关膜蛋白-2B（LAMP-2B），以及这些蛋白在细胞外液中可溶性对应物的缺失。这些特性允许使用特定生物标志物精确捕获定义的外泌体亚群。
研究人员开发了针对拟南芥外泌体标志蛋白TET8胞外结构域（EC2）的天然抗体，通过免疫沉淀从根分泌物中高效分离TET8阳性外泌体。该方法鉴定了功能性 cargo 分子，包括RNA结合蛋白和小RNA。
尽管该技术可高纯度分离特定外泌体亚群，但存在显著局限性。只能捕获抗体识别蛋白的亚群，可能因外泌体异质性导致分析偏差。抗体开发昂贵且易失活，限制大规模生产。此外，单亚群的特异性分离导致总外泌体产量较低。
免疫亲和捕获方法分离PELNs存在一些不足。PELNs所处的细胞环境与其他生物体（包括动物）的外泌体不同。此外，植物细胞壁成分复杂，外泌体提取过程中可能残留部分细胞壁碎片和其他杂质，这些可能干扰抗原和抗体的特异性结合，影响免疫亲和捕获的分离效果。
**4. 使用PELNs作为药物递送载体的优势**
在开发新型治疗策略的过程中，研究人员必须应对一系列挑战，如药物递送效率问题、组织靶向精度、可能的脱靶效应、安全性 profile、毒理学风险和大规模生产成本。尽管经过数十年发展，现有纳米载体——如脂质体、聚合物纳米颗粒和金属纳米材料——仍面临若干根本限制，包括肿瘤靶向效率差、免疫原性导致的快速清除以及规模化挑战。虽然动物源外泌体具有生物相容性，但其临床转化受到产量低和生产成本高的阻碍。
相比之下，PELNsElevato 是先进、无害、环境友好、稳健且可行的纳米医学载体。由于其天然来源和组成，PELNs不被免疫系统检测，允许更长的循环时间和更好的生物利用度。此外，与哺乳动物不同，植物不含动物源性或人类病原体，表现出低免疫原性和毒性，以及低胆固醇含量，使其在体内高度稳定和生物相容。因此，PELNs优于哺乳动物细胞来源的外泌体。这一优势还归因于PELNs在靶位点高效摄取、高产量递送治疗剂以及经济可行的生产能力。
**4.1. 高安全性**
**4.1.1. 低毒性**
PELNs表现出低毒性，是源自植物的天然生化物质，展现出有利的治疗效果。研究表明，从可食用植物中提取的纳米载体是最安全的治疗载体之一，主要原因是它们不诱导细胞毒性。此外，目前没有证据表明PELNs的使用会导致炎症和毒性。因此，这些纳米颗粒被视为基于共聚物、金属（Au/Ag）和碳的人工纳米载体的更安全替代品。
在多项体外细胞毒性研究中，各种植物来源的PELNs均表现出优异的安全性。研究人员评估了木瓜PELNs的毒性，发现用5–100 μg/mL PELNs处理RAW 264.7巨噬细胞24 h后，细胞存活率保持在80%以上，达到无毒性标准。该研究进一步显示，木瓜PELNs降低亚硝酸盐浓度，下调促炎细胞因子表达，上调抗炎细胞因子表达，进一步证明其安全性和功能性的和谐统一。
葡萄源外泌体样纳米囊泡（GELNs）在安全性评估中表现突出。研究人员从高浩葡萄中分离出理想粒径（~160 nm）和双层膜结构的GELNs。蛋白质组学结合原位透射电子显微镜证实其通过MVB途径形成和分泌。实验研究证实GELNs不表现细胞毒性或全身毒性，为口腔炎症提供了新型无毒纳米治疗策略。研究进一步证明，口服GELNs诱导小鼠肠道干细胞增殖，显著保护其免受硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的结肠炎，未观察到毒性副作用。
**4.1.2. 低免疫原性**
PELNs的另一核心安全特性是其显著降低的免疫原性，使其特别适合长期给药和重复治疗。研究人员报道，口服提取自西兰花的PELNs通过触发AMPK介导的耐受性树突状细胞形成保护小鼠抵御结肠炎，实现了全身免疫耐受诱导而不激活适应性免疫。
多项原始研究的直接证据支持这一安全性：葡萄源PELNs在口腔炎症模型中未显示细胞毒性或全身毒性，蛋白质组学和透射电子显微镜分析证实MVB途径来源形成；木瓜PELNs在5–100 μg/mL浓度下维持>80%的RAW 264.7巨噬细胞活力，同时减少促炎细胞因子，达到无毒性标准；口服姜源PELNs保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎，未观察到毒性副作用。此外，葡萄柚PELNs在肠道巨噬细胞中特异性积累而不触发全身炎症反应，人参PELNs在静脉注射后对孕鼠无不良影响且未能穿过胎盘屏障。这些跨越多种植物来源的原始研究共同确立PELNs具有固有低免疫原性，治疗应用中未报告显著免疫相关不良反应。
**4.2. 更高的靶向潜力**
PELNs具有巨大的靶向潜力。其对降解的固有能力确保口服给药后在唾液、胃酸和肠道蛋白酶作用下的存活。它们高效在肠道积累并被特定细胞选择性摄取，展现出独特的肠道靶向特性。PELNs通过各种机制实现向免疫细胞、干细胞、癌细胞和T淋巴细胞的精确递送。例如，姜源PELNs（GELENs）利用表面天然配体——包括植物特异性脂质如磷脂酸和双半乳糖甘油二酯、特定膜蛋白（如水通道蛋白和氯离子通道）、125种不同miRNAs，以及高浓度生物活性成分6-姜烯酚——形成多识别子系统实现精确靶向。
姜源外泌体优先被结肠巨噬细胞（CD11b
+F4/80
+，摄取率~11.6%）和上皮细胞（EpCAM
+，摄取率~9.9%）内化。它们通过上调血红素加氧酶-1和抑制IL-1β/TNF-α表达发挥抗炎作用。葡萄柚源外泌体也通过类似机制调节巨噬细胞极化。在T细胞相关免疫调节方面，PELNs可通过抑制促炎因子（TNF-α、IL-6）间接下调T细胞增殖和肠道归巢，或通过工程化白细胞膜包被的葡萄柚源外泌体囊泡利用LFA-1和CXCR1/CXR2配体直接干预T细胞运输。
干细胞修复方面，葡萄源外泌体穿透肠道粘液屏障激活Lgr5
+肠道干细胞中的Wnt/β-catenin通路，从而促进组织再生。癌症靶向方面，柠檬源外泌体通过激活TRAIL通路诱导肿瘤细胞凋亡，姜源外泌体通过降低cyclin D1表达和调节PKG/transgelin信号轴显著抑制AOM/DSS结肠癌模型中的肿瘤生长。
研究人员采用生物合成后策略，通过将叶酸（FA）接枝到姜源外泌体样纳米囊泡增强肿瘤靶向特异性。他们进一步证明，叶酸修饰的姜源外泌体样纳米囊泡可被工程化用于siRNA递送，通过静脉注射实现肿瘤抑制。该机制利用叶酸对癌细胞上过表达叶酸受体的高亲和力。
**4.3. 经济可行和可规模化生产**
植物为外泌体的大规模生产提供了卓越的经济优势。通过全面实验数据，研究人员确认PELNs在构建过程中相比人细胞源EVs实现了多重成本优化。在耗材层面，PELNs的制备不需要昂贵的血清、特定培养基或其他细胞培养用品，直接降低了基础材料成本。时间和劳动力成本方面，PELNs的生产效率更高，无需像人细胞培养那样频繁监测和调整培养环境，显著减少了大规模细胞培养所需的时间和劳动力投入。
此外，PELNs的来源广泛，常见水果和蔬菜如苹果和胡萝卜，以及水稻和烟草等经济作物，均可作为有效的PELNs提取来源。重要的是，PELNs的稳定供应可通过大规模种植实现，依托广阔的农田和先进的种植技术，无需动物细胞外泌体制造所需的复杂昂贵生物反应器。这大幅降低了生产设备的投入和运营成本，为推动产业化奠定了坚实的经济基础。
**5. PELNs作为药物递送载体的应用策略**
**5.1. PELNs的药物递送策略与方法**
PELNs可通过内源性或外源性方法装载。内源性装载是指植物细胞内自然过程，PELNs封装生物活性分子如植物次生代谢物、miRNAs、蛋白质和脂质。这种"预装载"状态使PELNs兼具载体和治疗剂的双重功能，无需额外工程化步骤。此外，单一囊泡内多种生物活性成分的共存提供协同治疗效果的优势，天然分子受到PELN脂质双层的保护，抵抗胃肠道降解。例如，在姜黄PELNs中，PA和PC协同促进摄取和迁移；在草莓PELNs中，维生素C的稳定性得到增强。
目前，外源性装载治疗剂的常用技术分为主动和被动策略。被动装载是指在特定温度设置下将PELNs与药物物质共同孵育，依赖药物分子的扩散及其与囊泡的脂溶性相互作用完成结合。该方法相对简单，但封装效率可能有限。然而，即使在被动装载条件下，PELNs对疏水药物的封装效率仍显著高于传统脂质体。这一优势源于其独特的脂质组成和稳定的膜结构。主动装载则包括共给药、超声、电穿孔、挤出和冻融循环等多种方法。
**5.1.1. 共孵育**
在DDS构建中，共孵育因其操作简便和通用性成为PELNs药物装载的基础技术。该方法利用分子间浓度梯度促进药物自发进入囊泡，通过自由扩散，无需复杂设备和专业操作，大幅降低技术门槛和生产成本。
共孵育在基因治疗中也展现出优异的适用性。miRNA模拟物可通过简单混合并在冰上孵育30 min高效装载到樱桃提取的EVs中。该过程避免了传统核酸转染复杂的化学修饰或电穿孔步骤，为核酸药物递送提供了简便有效的策略。
然而，共孵育存在明显的技术局限性。由于缺乏外部力驱动，药物分子仅依赖被动扩散进入囊泡，导致整体包封效率较低，无法满足大规模生产和高载药量的需求。具体而言，共孵育方法通常产生比大多数合成纳米颗粒更优越的miRNA装载效率，但仍低于电穿孔介导的动物外泌体装载效率。此外，药物的理化性质显著影响装载效果。亲脂性药物易与囊泡脂质双层结合，装载效率较高；而亲水药物由于与囊泡膜亲和力弱，高效装载往往困难。再者，共孵育过程中药物与囊泡比例、孵育时间和温度等参数影响最终载药量，需要优化。
**5.1.2. 超声处理**
超声是PELNs药物装载中常用且高效的方法。其原理是利用超声产生的能量和机械力，在极短时间内暂时改变PELNs的脂质双层结构。超声波通过液体介质时引发周期性压力变化，形成小的空化气泡。这些气泡的瞬间产生和破裂产生强大的冲击波和剪切力作用于脂质双层，诱导双层局部结构暂时松动或产生孔隙。此时，药物分子可利用这些暂时通道更有效地穿透PELNs。
与共孵育相比，超声方法在药物装载效率方面展现出明显优势。共孵育主要依赖药物分子的自然扩散，效率相对较低；而超声方法通过主动施加外部力显著加速药物分子的渗透速度，能在更短时间内实现更高的药物装载。关于超声对外泌体的影响，超声处理显著改变EVs的微粘度，但超声孵育1 h后微粘度逐渐恢复至初始水平，且超声未显著影响EVs的脂质和蛋白质含量。这表明超声在改变其结构以促进药物装载的同时，对囊泡主要组分含量的影响轻微。
超声处理是提高PELNs药物装载效率的有效主动装载方法，具有操作快速和相对较低的设备成本优势。在优化条件下（如适当的功率、时间和温度），超声有潜力使PELNs达到与动
